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果蔬采后病害会导致巨大的经济损失;生物防治取代化学杀菌剂用于果蔬采后病害的防治显示出巨大的潜力,并成为一个新的研究热点。砂糖桔为亚热带非跃变型果实,指状青霉是导致砂糖桔采后严重腐烂的主要疾病。本论文进行了砂糖桔采后病害生物控制的研究。主要研究了提取青蒿抗菌活性物质及其抑菌作用,对青蒿的不同部分提取物进行控制指状青霉生物活性测试,从生物活性较高的乙酸乙酯部分进一步提取抗菌物质,利用薄层色谱、柱层析等方法进行分离,最终得出两种抗菌活性较高的两种化合物,并进行了结构鉴定。利用四种酵母拮抗菌来进行砂糖桔采后病害控制;进行了BTH(苯并噻二唑)和BABA(β—氨基丁酸)处理对砂糖桔采后贮藏期间的绿霉病控制试验;研究了BTH和BABA对砂糖桔果实采后生理、防御酶活性和抗病相关基因的诱导作用。主要研究结果如下:
⑴青蒿是我国的传统中药,本文采用石油醚、石油醚—乙酸乙酯、乙酸乙酯等对青蒿浸膏进行萃取分离,以抑制砂糖桔采后致病菌指状青霉作为活性导向生测跟踪,对各部提取物进行了离体和活体抑菌试验,青蒿不同溶剂提取物对绿霉病病菌有不同程度的抑制作用,其中乙酸乙酯提取物的抑菌作用明显比石油醚和石油醚—乙酸乙酯提取物强,具有明显的防治效果,质量浓度为2000μg·ml—1的乙酸乙酯提取物较好抑制了砂糖桔绿霉病。利用薄层色谱、柱层析等方法,对青蒿提取物EA部分(Ⅲ)进行分离,并进行生物活性测试,继续分离后得到4个单一的化合物,经过抑菌试验,化合物B和化合物C有较好的抑菌活性,能强烈抑制指状青霉菌;通过红外谱图鉴定、质谱鉴定和熔点测试,确定化合物B是青蒿素B;化合物C是α—松油醇。
⑵探索了四种酵母对砂糖桔绿霉病的控制效果;NYDB抑菌试验中p.membranaefaciens和R.rubra处理的病原菌的萌发率较低,芽管伸长度也明显降低。试验表明接种1.5×106 CFU/mL p.membranaefaciens和R.rubra酵母菌悬液,对接种1.2×104 CFU/mL指状青霉有很好的抑制作用。R.rubra结合2%CaCl2能显著促进R.rubra的抑菌效果,而p.membranaefaciens结合2% NaHCO3能显著促进p.membranaefaciens的抑菌效果;外加1%蔗糖和0.2%蛋白胨浓度都能增加酵母拮抗菌的抑制能力。p.membranaefaciens和R.rubra能迅速在砂糖桔伤口上定殖。
⑶研究了BTH处理对砂糖桔采后绿霉病的控制,在负压下用0.1g/L BTH、0.05g/L BTH、0.025g/L BTH、0.0125g/L BTH、0.0g/L BTH处理,结果显示0.025g/LBTH处理能有效减少砂糖桔绿霉病的发生;能够显著地减小病斑面积;显著地降低了砂糖桔贮藏期间自然发病率;BTH不能对离体生长的病原菌产生抑制作用。BTH处理诱导了砂糖桔果皮中几丁质酶(CHT)和β—1,3—葡聚糖酶(GUN)活性的提高,表明在采后砂糖桔果实的诱导抗病过程中可能会伴随病程相关蛋白(PRP)的产生;还诱导了过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性,提高了过氧化氢(H2O2)含量,降低了MDA含量。
⑷研究了BABA处理对砂糖桔采后绿霉病的控制,在负压下用2g/L BABA、lg/L BABA、0.5g/L BABA、0.25g/L BABA、0.0g/L BABA处理,结果显示0.5g/LBABA处理能有效减少砂糖桔绿霉病的发生;能够显著地减小病斑面积;显著地降低了砂糖桔贮藏期间自然发病率;BABA不能对离体生长的病原菌产生抑制作用。BABA处理诱导了砂糖桔果皮中几丁质酶(CHT)和β—1,3—葡聚糖酶(GUN)活性的提高,表明在采后砂糖桔果实的诱导抗病过程中可能会伴随病程相关蛋白(PRP)的产生;还诱导了过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性,提高了过氧化氢(H2O2)含量,降低了MDA含量。
⑸砂糖桔CHT和GUN基因3’末端cDNA序列的克隆是进一步研究BTH和BABA在分子水平上的抗病机理的基础。Northern杂交结果表明,在BTH和BABA处理后砂糖桔贮藏前期,CR—CHT1和CR—BG3的基因表达逐渐增强,在贮藏后期维持了一定的水平;CR—CHT1和CR—BG3的基因有协同表达作用;结果表明BTH和BABA对砂糖桔果实中这两个基因的表达水平都有不同程度的诱导作用,这种诱导方式与系统获得抗性相似(SAR)。