旋毛虫是旋毛形线虫的简称,是一类成虫和幼虫分别寄生于同一宿主的小肠和肌细胞内的线虫,宿主主要是由于食入含有活幼虫囊包的肉类及其制品而感染。人和多种哺乳动物可作为该虫的宿主,超过150种的动物可以感染旋毛虫。由旋毛虫引起的旋毛虫病是重要的人畜共患寄生虫病之一,它是呈全球性分布的动物源性寄生虫病,严重感染时可致人畜死亡。　　 旋毛虫病的临床症状复杂多样,病原诊断比较困难,常用的抗蠕虫药物阿苯哒唑和甲苯咪唑的有效性仅限于病症的早期阶段,而早期诊断又是获得有效治疗的基础,所以加大了预防和控制旋毛虫病感染的难度。这些难点促使人们把注意力转向功能基因或抗原分子的鉴定,筛选并鉴定出在抗旋毛虫感染中起着重要作用的具有免疫原性及保护性的抗原分子,或对致病起关键作用的基因,以此加强对旋毛虫疫苗的研制和促进旋毛虫病的防治工作。而随着旋毛虫基因组测序工作的完成,对旋毛虫的研究必将进入后基因组时代,所以建立一种有效的基于基因表达水平操控的技术对深入了解旋毛虫分子生物学水平并发现新的药物靶点变得尤为重要,它将为加强旋毛虫基因功能的研究提供一种新的手段。　　 副肌球蛋白是多种无脊椎动物肌肉组织主要结构蛋白,最初是在软体动物的平滑肌中被发现的。多项研究证明此蛋白是多种无脊椎动物主要抗原成分,在很多寄生虫特别是蠕虫体内广泛存在。本课题组已经通过分子生物学方法从旋毛虫cDNA文库中筛选获得了旋毛虫副肌球蛋白(Paramyosin,Pmy)抗原新基因,研究证实其重组蛋白诱导宿主免疫反应并在小鼠体内产生一定的免疫保护效果;同时也发现虫体体表的Ts-Pmy可与人补体C8、C9结合,抑制膜攻击复合物的形成,参与虫体的免疫逃避。另外,也筛选到了两个抗原表位,并证实其保护性效果优于全长蛋白。尽管以上结果一定程度上已证明了副肌球蛋白可以作为抗旋毛虫的有效疫苗候选抗原分子,但它对旋毛虫在宿主体内的寄生状态的影响除了它能与人的补体C8和C9结合之外,是否还存在着其它的一些生物学功能并未得到进一步的研究。随着RNA干扰技术的深入研究和广泛应用,本实验将通过副肌球蛋白基因表达水平的沉默效应来进一步明确目的基因的生物学功能。　　 首先,确定目的基因经干扰后基因表达水平是否受到抑制。先根据Ts-pmy基因序列设计并合成三对小干扰RNA(siRNA),同时通过体外转录合成三对长双链RNA(dsRNA);接着做导入实验,分别通过电穿孔和浸泡两种方法将siRNA/dsRNA导入旋毛虫肌幼虫和成虫体内;然后通过荧光定量PCR检测肌幼虫和成虫体内目的基因Ts-pmy的表达量。实验结果表明,抑制效果最好的一对siRNA1743和dsRNA-PF3对肌幼虫的抑制率分别为66.3％(8μM处理浓度)和60.4％(50μg处理浓度);同时证明电穿孔导入方式优于浸泡导入方式;再者证明了肌幼虫目的基因基因水平表达量的下调随着siRNA/dsRNA使用浓度的增加和培养时间的延长而逐步加强。　　 其次,在目的基因表达水平受抑制前提下,进一步证明其蛋白水平的表达是否受影响。Western-blot结果显示,经siRNA1743处理后,与controlsiRNA作比较,肌幼虫和成虫目的基因的蛋白表达量分别下调了52.0％和74.5％(8μM处理浓度);经dsRNA-PF3处理的虫体,与controldsRNA作统计学分析,肌幼虫和成虫Ts-Pmy蛋白表达量分别下调了64.7％和63.5％(25μg处理浓度)。　　 再者,确定了基因水平和蛋白水平都成功被下调之后,观察旋毛虫出现的各种可监测的表型差异性。主要观察指标包括虫体的活力和生长发育。活力方面,本实验借用一种与DNA相结合时便可激发出绿色荧光的SYTOX核酸染料,通过荧光亮度和密度来确定虫体细胞损伤的累积程度,进而判断虫体的活力变化情况。另外,生长发育方面主要从肌幼虫蜕皮的指数进行监测。由实验结果可知,经RNA干扰之后的虫体,加入SYTOX染料后,siRNA1743组的荧光亮度和密度远远强于controlsiRNA组和未处理组,同时荧光密度的比值随着体外培养时间的延长而逐步上调,说明实验组虫体活力的下降水平远远强于controlsiRNA组。另外,从结果可以看出,与controlsiRNA组作比较,siRNA1743处理组的蜕皮率远远低于对照组,siRNA1743处理组的蜕皮率约30.0％,而controlsiRNA组的蜕皮率约60.0％,且各组之间的蜕皮指数并未随着体外培养时间的延长而变化。　　 最后是关于体内实验。由于重组Ts-Pmy已经被证明是有效的疫苗候选抗原分子,其免疫小鼠后,刺激产生了高水平的Th2细胞介导的体液免疫,产生一定的免疫保护效果,所以本实验通过体内实验来进一步监测接受了siRNA干扰之后的虫体对动物的感染能力是否下降。通过电穿孔导入方式将各组siRNA导入肌幼虫体内,体外培养3h后经口喂养BALB/c小鼠,4天后处死小鼠,取小肠,收集成虫,计数以评估成虫的减虫率;同时,将所得成虫中的雌虫体外培养计算其新生蚴产出量及新生蚴的死亡率以评估雌虫的生殖力。另外,45天后处死另一批小鼠,取肌肉消化收集肌幼虫计数以评估肌幼虫的减虫率。由实验结果可知,与controlsiRNA组比较,siRNA1743处理组成虫减虫率为37.6％,肌幼虫减虫率为22.6％。新生蚴产出量方面,siRNA1743组与controlsiRNA组比较,产量减少了24.8％,差异有统计学意义,但新生蚴的死亡率方面,结果无统计学意义。　　 综上所述,通过以上实验,我们初步证明了外源性的siRNA和dsRNA可以被成功地导入旋毛虫肌幼虫和成虫体内,而特异性的siRNA和dsRNA可以有效地下调目的基因Ts-Pmy基因水平和蛋白水平的表达量,并引起可观察的表型差异性,即Ts-pmy基因的下调对虫体的活力和生长发育存在一定的影响。同时,通过体内动物实验的减虫率,进一步证明了Ts-Pmy基因表达量的下调,导致虫体免疫逃避功能降低,在宿主体内存活率下降。总之,本实验不仅证明了Ts-Pmy的部分生物学功能,为Ts-Pmy的进一步研究提供实验依据,而且初步确立了RNA干扰机制在旋毛虫体内的存在,为新的药物靶点的发现和疫苗的研制提供了一个新的平台,为旋毛虫病的防治工作提出了新的思路。