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目的：利用低温刺激建立冷致高血压(Cold-induced hypertension，CIH)大鼠模型，并进行交叉粪菌移植，通过微生物16SrDNA扩增子绝对定量测序分析肠道菌群组成变化，探讨肠道菌群、ANGⅡ-AT1R通路与CIH发生发展之间的联系及可能机制。
方法：购入SPF级SD大鼠64只，适应性饲养一周，按体重随机分为常温组(Normaltemperaturegroup，NT，n=32)和低温组(Lowtemperaturegroup,LT，n=32)。将LT组大鼠置于洁净级人工气候环境模拟箱中(4±1℃)，进行连续低温刺激(22h/天)，NT组置于洁净级常温动物室(20±2℃)饲养，连续低温刺激6周建立CIH大鼠模型，筛选粪菌移植供体大鼠并收集粪便，分四组进行交叉粪菌移植，分别为常温组大鼠+低温大鼠粪便组(NL组，n=9)、常温组大鼠+常温大鼠粪便组(NN组，n=9)、低温组大鼠+常温大鼠粪便组(LN组，n=9)及低温组大鼠+低温大鼠粪便组(LL组，n=9)，两周内进行三次粪菌移植。测定指标及分析如下：
(1)低温刺激期间每日监测大鼠食物摄取量(g)及饮水量(mL)，每周测定大鼠体重(g)、心率(次/min)、肛温(℃)和血压(mmHg)，包括收缩压(Systolic blood pressure，SBP)、舒张压(Diastolic blood pressure，DBP)、平均压(Mean blood pressure，MBP)，粪菌移植后同样监测上述指标。
(2)三次粪菌移植结束后处理大鼠，采集大鼠全血并分离血浆，摘取大鼠脑、心脏、肾脏、肝脏并称重，计算脏器系数(%)；检测各组大鼠血脂水平，测定指标包括总胆固醇(Total cholesterol，T-CHO)、甘油三酯(Triglyceride， TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)及高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)。
(3)低温刺激及粪菌移植结束后，采集大鼠粪便，进行16SrDNA微生物扩增子测序，利用测序数据分别进行OTU分析、Alpha多样性分析、Beta多样性分析及菌群显著性差异分析，并通过Spearman相关性分析在科水平及属水平与SBP显著相关的菌群。
(4)检测大鼠血浆血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，ANGⅡ)、一氧化氮(Nitric oxide，NO)浓度，测定大鼠肾组织超氧化物歧化酶(Superoxide diamutase，SOD)、诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)及乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase，LDH)活力；利用WesternBlotting测定大鼠肾组织中血管紧张素Ⅱ1型受体(AngiotensinⅡreceptors1，AT1R)表达水平；取大鼠回肠及结肠组织，制作HE病理切片，观察肠道病理变化。
(5)制作结肠免疫组织化学切片，检测黏蛋白2(Mucoprotein 2，MUC 2)、紧密连接蛋白(Occludin，OCLN)的表达水平，并进行半定量分析；取大鼠粪便，利用气相色谱仪测定粪便中乙酸、丙酸、丁酸的代谢水平。
结果：(1)低温刺激期间，LT组大鼠摄食量较NT组大鼠高(P<0.05)，体重在第一周后显著低于NT组(P<0.05)，饮水量在第一周、第二周及第五周显著低于NT组(P<0.05)。LT组大鼠血压在低温刺激前两周出现明显增高，在第三周后下降，随后保持较高且稳定水平，第三周到第六周LT组SBP分别为142.33±10.38mmHg，141.83±12.40mmHg，139.65±11.51mmHg，137.99±11.66mmHg，与NT组大鼠相比差异具有统计学意义(P<0.05)。三次粪菌移植结束后，LL、LN组大鼠SBP显著高于NN组(P<0.05)；虽差异无统计学意义(P>0.05)，但NL组大鼠SBP高于NN组，LL组大鼠SBP高于LN组。粪菌移植结束后，LN组大鼠T-CHO、TG、HDL均显著高于NN、NL组(P<0.05)；LL组大鼠T-CHO、TG浓度显著高于NL组(P<0.05)，LL组大鼠HDL浓度显著高于NN及NL组(P<0.05)；对于LDL，各组之间并无统计学差异(P>0.05)。
(2)16SrDNA扩增子测序结果显示，在门水平，占比在前三位的分别为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)及变形菌门(Proteobacteria)。低温刺激及粪菌移植后，各组大鼠肠道菌群组成变异较大，LL组厚壁菌门/拟杆菌门比值升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。Alpha多样性及Beta多样性分析结果显示，低温刺激及粪菌移植使肠道菌群多样性降低，且组间差异大于组内差异。差异性菌群分析结果显示，NT组中有益菌富集而LT组中致病菌或条件致病菌富集，粪菌移植后菌群组成发生较大变化。利用Spearman相关分析筛选出六种菌群在科水平与粪菌移植后SBP呈显著相关关系，其中氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)与SBP呈正相关，毛螺菌科(Lachnospiraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、消化球菌科(Peptococcaceae)、ClostridialesvadinBB60group及Elusimicrobiaceae与SBP呈负相关；在属水平，只有考拉杆菌属(Phascolarctobacterium )与SBP呈正相关，Ruminiclostridium9、颤杆菌属(Oscillibacter)、RikenellaceaeRC9gutgroup与SBP呈负相关。
(3)与NN、NL组相比，LL、LN组大鼠血浆ANGⅡ浓度显著升高(P<0.05)，LL、LN组大鼠肾组织SOD活力显著降低(P<0.05)，LN组及LL组大鼠肾组织AT1R受体表达显著增加(P<0.05)。与NN组相比，NL、LL、LN组血浆NO浓度显著降低(P<0.05)，大鼠肾组织LDH活力升高，但各组间差异无统计学意义(P>0.05)，NL、LN组大鼠iNOS活力显著升高(P<0.05)。肠道病理显示LL组、LN组大鼠肠壁厚度降低，肠绒毛有所增高，宽度增宽。
(4)经过六周的低温刺激，粪便中乙酸、丙酸的含量均降低，仅丁酸含量在LT组中显著降低(P<0.05)。粪菌移植后，LL、LN组丁酸含量仍低于NN、NL，但差异无统计学意义(P>0.05)。与NN、NL组相比，LN、LL组MUC2、OCLN表达水平显著降低(P<0.05)。
结论：
(1)连续低温刺激可导致SD大鼠血压升高并形成CIH，粪菌移植可以调节血压；
(2)CIH大鼠肠道菌群的组成发生紊乱，致病菌或条件致病菌富集明显，粪菌移植可改变CIH大鼠肠道菌群组成；
(3)CIH大鼠血浆中ANGⅡ浓度升高，并通过AT1R的作用介导血管收缩，血压升高；
(4)肠道菌群可通过相关代谢产物调节CIH大鼠肠道屏障功能、氧化应激及血压变化；
(5)低温刺激可导致肠道菌群及其代谢产物与ANGⅡ-AT1R通路发生变化，进而形成CIH。
方法：购入SPF级SD大鼠64只，适应性饲养一周，按体重随机分为常温组(Normaltemperaturegroup，NT，n=32)和低温组(Lowtemperaturegroup,LT，n=32)。将LT组大鼠置于洁净级人工气候环境模拟箱中(4±1℃)，进行连续低温刺激(22h/天)，NT组置于洁净级常温动物室(20±2℃)饲养，连续低温刺激6周建立CIH大鼠模型，筛选粪菌移植供体大鼠并收集粪便，分四组进行交叉粪菌移植，分别为常温组大鼠+低温大鼠粪便组(NL组，n=9)、常温组大鼠+常温大鼠粪便组(NN组，n=9)、低温组大鼠+常温大鼠粪便组(LN组，n=9)及低温组大鼠+低温大鼠粪便组(LL组，n=9)，两周内进行三次粪菌移植。测定指标及分析如下：
(1)低温刺激期间每日监测大鼠食物摄取量(g)及饮水量(mL)，每周测定大鼠体重(g)、心率(次/min)、肛温(℃)和血压(mmHg)，包括收缩压(Systolic blood pressure，SBP)、舒张压(Diastolic blood pressure，DBP)、平均压(Mean blood pressure，MBP)，粪菌移植后同样监测上述指标。
(2)三次粪菌移植结束后处理大鼠，采集大鼠全血并分离血浆，摘取大鼠脑、心脏、肾脏、肝脏并称重，计算脏器系数(%)；检测各组大鼠血脂水平，测定指标包括总胆固醇(Total cholesterol，T-CHO)、甘油三酯(Triglyceride， TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)及高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)。
(3)低温刺激及粪菌移植结束后，采集大鼠粪便，进行16SrDNA微生物扩增子测序，利用测序数据分别进行OTU分析、Alpha多样性分析、Beta多样性分析及菌群显著性差异分析，并通过Spearman相关性分析在科水平及属水平与SBP显著相关的菌群。
(4)检测大鼠血浆血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，ANGⅡ)、一氧化氮(Nitric oxide，NO)浓度，测定大鼠肾组织超氧化物歧化酶(Superoxide diamutase，SOD)、诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)及乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase，LDH)活力；利用WesternBlotting测定大鼠肾组织中血管紧张素Ⅱ1型受体(AngiotensinⅡreceptors1，AT1R)表达水平；取大鼠回肠及结肠组织，制作HE病理切片，观察肠道病理变化。
(5)制作结肠免疫组织化学切片，检测黏蛋白2(Mucoprotein 2，MUC 2)、紧密连接蛋白(Occludin，OCLN)的表达水平，并进行半定量分析；取大鼠粪便，利用气相色谱仪测定粪便中乙酸、丙酸、丁酸的代谢水平。
结果：(1)低温刺激期间，LT组大鼠摄食量较NT组大鼠高(P<0.05)，体重在第一周后显著低于NT组(P<0.05)，饮水量在第一周、第二周及第五周显著低于NT组(P<0.05)。LT组大鼠血压在低温刺激前两周出现明显增高，在第三周后下降，随后保持较高且稳定水平，第三周到第六周LT组SBP分别为142.33±10.38mmHg，141.83±12.40mmHg，139.65±11.51mmHg，137.99±11.66mmHg，与NT组大鼠相比差异具有统计学意义(P<0.05)。三次粪菌移植结束后，LL、LN组大鼠SBP显著高于NN组(P<0.05)；虽差异无统计学意义(P>0.05)，但NL组大鼠SBP高于NN组，LL组大鼠SBP高于LN组。粪菌移植结束后，LN组大鼠T-CHO、TG、HDL均显著高于NN、NL组(P<0.05)；LL组大鼠T-CHO、TG浓度显著高于NL组(P<0.05)，LL组大鼠HDL浓度显著高于NN及NL组(P<0.05)；对于LDL，各组之间并无统计学差异(P>0.05)。
(2)16SrDNA扩增子测序结果显示，在门水平，占比在前三位的分别为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)及变形菌门(Proteobacteria)。低温刺激及粪菌移植后，各组大鼠肠道菌群组成变异较大，LL组厚壁菌门/拟杆菌门比值升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。Alpha多样性及Beta多样性分析结果显示，低温刺激及粪菌移植使肠道菌群多样性降低，且组间差异大于组内差异。差异性菌群分析结果显示，NT组中有益菌富集而LT组中致病菌或条件致病菌富集，粪菌移植后菌群组成发生较大变化。利用Spearman相关分析筛选出六种菌群在科水平与粪菌移植后SBP呈显著相关关系，其中氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)与SBP呈正相关，毛螺菌科(Lachnospiraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、消化球菌科(Peptococcaceae)、ClostridialesvadinBB60group及Elusimicrobiaceae与SBP呈负相关；在属水平，只有考拉杆菌属(Phascolarctobacterium )与SBP呈正相关，Ruminiclostridium9、颤杆菌属(Oscillibacter)、RikenellaceaeRC9gutgroup与SBP呈负相关。
(3)与NN、NL组相比，LL、LN组大鼠血浆ANGⅡ浓度显著升高(P<0.05)，LL、LN组大鼠肾组织SOD活力显著降低(P<0.05)，LN组及LL组大鼠肾组织AT1R受体表达显著增加(P<0.05)。与NN组相比，NL、LL、LN组血浆NO浓度显著降低(P<0.05)，大鼠肾组织LDH活力升高，但各组间差异无统计学意义(P>0.05)，NL、LN组大鼠iNOS活力显著升高(P<0.05)。肠道病理显示LL组、LN组大鼠肠壁厚度降低，肠绒毛有所增高，宽度增宽。
(4)经过六周的低温刺激，粪便中乙酸、丙酸的含量均降低，仅丁酸含量在LT组中显著降低(P<0.05)。粪菌移植后，LL、LN组丁酸含量仍低于NN、NL，但差异无统计学意义(P>0.05)。与NN、NL组相比，LN、LL组MUC2、OCLN表达水平显著降低(P<0.05)。
结论：
(1)连续低温刺激可导致SD大鼠血压升高并形成CIH，粪菌移植可以调节血压；
(2)CIH大鼠肠道菌群的组成发生紊乱，致病菌或条件致病菌富集明显，粪菌移植可改变CIH大鼠肠道菌群组成；
(3)CIH大鼠血浆中ANGⅡ浓度升高，并通过AT1R的作用介导血管收缩，血压升高；
(4)肠道菌群可通过相关代谢产物调节CIH大鼠肠道屏障功能、氧化应激及血压变化；
(5)低温刺激可导致肠道菌群及其代谢产物与ANGⅡ-AT1R通路发生变化，进而形成CIH。