细菌活的非可培养状态(viable but nonculturable state，VBNC)是细菌处于不良环境条件下，细胞缩成球形，用常规方法培养不能生长繁殖，但仍然是一种特殊的活的存在形式。进入活的非可培养状态的细菌在一定的条件下可以复苏并仍具有毒力，具有潜在的致病性。本研究探讨副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)在低温、寡营养、低盐度的环境中是否进入VBNC状态，以及进入VBNC状态后细菌形态的变化，研究VBNC状态细菌复苏为可培养状态的条件，并且对复苏的副溶血弧菌基本代谢特征、毒力基因进行检测，并建立快速检测VBNC状态的副溶血弧菌的新方法。主要研究内容和结果如下：　　 1、本研究确定副溶血弧菌菌株进入活的非可培养状态的诱导方式为低温、寡营养、低盐度条件。分别用吖啶橙染色荧光显微镜计数法(AODC)、死/活细菌检测试剂盒和涂布平板法(PC)研究副溶血弧菌能否进入VBNC状态。将副溶血弧菌接种于灭菌陈海水中，分别静置于4℃和25℃条件进行诱导，研究发现，当诱导温度为4℃时，初始浓度为3.0×109CFU/mL副溶血弧菌在诱导的第75 d检测不到可培养菌数，此时大部分副溶血弧菌已进入VBNC状态。而当诱导温度为25℃时，在诱导的第75 d，可培养细菌数下降为3.0×106 CFU/mL，在此有限的时间内，并没有使副溶血弧菌进入VBNC状态。结果表明，温度是诱导副溶血弧菌进入VBNC状态的显著因子之一，在低温的条件下，副溶血弧菌更容易进入VBNC状态。　　 此外，将初始浓度为3.0×109 CFU/mL副溶血弧菌分别接种于盐度0.5％、盐度1.0％无菌水溶液中，静置于4℃下诱导，分别在诱导的第45 d和第55 d均检测不到可培养菌数，此时大部分副溶血弧菌已进入了VBNC状态，并且在盐度0.5％条件下可培养菌数下降的更快些，更早进入VBNC状态。结果表明，副溶血弧菌在低温低盐度条件下更容易进入VBNC状态。　　 2、对VBNC状态的实验菌株的复苏采用了多种方法，包括升温复苏法，添加营养物质升温复苏法以及添加化学物质升温复苏法，研究发现采用添加酵母液升温复苏法、添加液体培养基升温复苏法、添加酵母液和吐温80升温复苏法及添加丙酮酸钠升温复苏法均使VBNC状态的副溶血弧菌在24 h内复苏为可培养状态。　　 3、利用扫描电镜技术对正常状态、VBNC状态和复苏后的副溶血弧菌的形态进行了研究，结果表明，进入VBNC状态后，副溶血弧菌在形态上发生了变化，即由原来的杆状、短杆状或弧状变为球状，并且体积比正常状态的副溶血弧菌明显缩小，正常状态的细胞大小约为2.0×0.5um，而处于VBNC状态下的球状细胞平均直径为0.5 um;复苏后副溶血弧菌的形态与正常状态副溶血弧菌相比几乎没有差异。　　 4、对复苏后的菌落进行PCR扩增，均检测到副溶血弧菌溶血毒素t/h基因，并结合AP120E生化鉴定试剂盒进行检测，结果表明复苏后的菌为副溶血弧菌，鉴定百分比为92.8％。同时，API 20E检测后还发现，添加营养物质复苏和添加丙酮酸钠复苏的副溶血弧菌具有相同的代谢特征，并且与正常副溶血弧菌基本相同，只有尿素酶、发酵阿拉伯糖产酸反应发生了变化，推测经历VBNC状态的副溶血弧菌复苏后基本恢复了正常的代谢过程。　　 5、本研究将EMA的选择透过性与PCR技术相结合，建立了快速检测VBNC状态副溶血弧菌的EMA-PCR方法。通过实验最终确定的EMA最佳浓度为45ug/mL，对VBNC状态的副溶血弧菌进行PCR扩增，能够扩增出450 bp大小的目的条带，而死菌则不能扩增出目的条带。可见EMA-PCR方法成功扩增出VBNC状态的副溶血弧菌的tlh基因，能够作为快速检测VBNC状态细菌的新方法。