草莓花药培养以及草莓镶脉病毒检测技术研究

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本研究对草莓两个品种‘丰香’、‘雪蜜’花药培养再生体系进行了系统性研究,并根据GenBank序列查询的结果,利用计算机软件设计引物,对草莓镶脉病毒利用PCR技术在分子水平进行检测,主要研究结果如下: 1. 筛选出最佳花蕾消毒时间,以70%酒精消毒5s+0.1%升汞(附加吐温)浸泡8min消毒最好;接种前花蕾低温(4℃)处理3d为好,愈伤组织诱导MS为基本培养基,附加BA0.5mg·L<-1>+NAA2.0 mg·L<-1>+KT0.1mg·L<-1>+蔗糖30g·L<-1>培养基为好,分化培养基MS+BA1.5mg·L<-1>+NAA0.5mg·L<-1>+ZT2.0mg·L<-1>+蔗糖30g·L<-1>为宜。适宜草莓增殖培养基为:MS+BA0.5mg·L<-1>+NAA0.1 mg·L<-1>。获得43个“雪蜜”和161个“丰香”再生株系,其再生率分别为37.5%和4.7%。 2. 通过对再生植株根尖染色体计数分析,结果显示八倍体(2n=8x=56)值株,占80%;以再生植株为材料,利用PCR技术对莓镶脉病毒和ELISA技术对草莓环斑病毒检测,证明花培植株不携带上述两种病毒。 3. 利用改进的CTAB法提取草莓叶片DNA,用氯仿/异戊醇(24:1)抽提时,将离心转速提高到14000rpm,离心后减少上清液的吸取量,很好地去除了蛋白,获得了质量较高的草莓基因组DNA。 4. 利用PCR技术在分子水平对草莓镶脉病毒(SVBV)进行检测,建立了扩增反应体系,并对扩增体系进行了优化:在50μL体系中,10×PCRbuffer 5μL,MgCl<,2>5μL,dNTPs1.6μL,Taq酶0.25μL,模板DNAlμL.筛选的最佳退火温度为58℃。 5.经过扩增产物序列测定和同源性比较,扩增片段与已报道的草莓镶脉病毒外壳蛋白基因序列同源性为97%,证明PCR检测体系有非常高的准确性。
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