论文部分内容阅读
有证据表明，TET蛋白家族具有将DNA中5mc(DNA5甲基胞嘧啶)转化为5hmc(5羟甲基胞嘧啶)，5fC（5醛基胞嘧啶）和5caC（5羧基胞嘧啶）的能力，并以此参与DNA去甲基化的过程。另外，有研究表明约有15％的肿瘤与体细胞TET2蛋白突变有关系。我们的研究希望通过X射线晶体学的方法对小鼠Tet2蛋白进行结构解析，以此来揭示TET蛋白在DNA去甲基化的过程中所扮演的角色，进而阐明TET蛋白相关的DNA去甲基化的过程和TET2蛋白在肿瘤发生中的作用。
以张毅教授实验室得到的小鼠Tet2的cDNA为模板，通过PCR扩增，限制内切酶酶切，T4连接酶连接，转化等分子生物学手段将Tet2的催化亚基的截短片段亚克隆到表达载体中去。经鉴定成功后，转化入表达菌中进行诱导表达。对于表达成功的蛋白采用亲和层析，离子交换层析，分子筛等纯化方法进行蛋白质的纯化。通过动态光散射来获得蛋白质均一性的信息。并进行晶体的筛选。
值得说明的是这些TET2蛋白催化亚基片段是否有活性需要进一步验证，但即使活性缺失，由于TET家族蛋白尚没有催化区域的结构，如果能够通过晶体学手段获得晶体结构，对于我们理解TET家族蛋白的催化原理仍然具有重要的意义。
最终我获得了一些可以可溶表达的表达TET2催化亚基的亚克隆。并获得纯度较高的，均一性较好的Tet2融合蛋白。但是没有通过晶体筛选获得可以用以X射线衍射的蛋白质或者复合物晶体。