蓝猪耳JA合成关键酶基因克隆、表达和AOC基因的遗传转化

来源 :华南师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:brinsh
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茉莉酸类物质是广泛存在于植物中的一类激素,调控着植物的生长发育。蓝猪耳(Torenia fournieriL.)具有裸露的胚囊,是研究受精生物学的模式植物,本文以其为实验材料,对JA合成途径的关键酶基因进行了初步研究,主要研究结果如下:  设计特异引物,从蓝猪耳中克隆得到TfLOX、TfAOS、TfAOC和TfGAPDH基因的部分片段,其核苷酸序列长度分别为179bp、226bp、723bp和349bp,4个基因与其它物种中的TfLOX、TfAOS、TfAOC和TfAPDH基因分别具有较高的同源性,其中TfLOX与茄属LOX(AAD09202)的氨基酸序列同源性为81%,TfAOS与蓖麻P450亚家族蛋白(XP-002510320)的氨基酸序列同源性为74%,TfAOC与牵牛花AOC(ACD12705)的氨基酸序列同源性为66%,TfGAPDH与拟南芥GAPDH(P34921)的氨基酸序列同源性为98%。  半定量RT-PCR研究表明,TfLOS、TfAOS和TfAOC基因在蓝猪耳幼苗期和开花期的根、茎和叶中表达水平不相同,TfLOX和TfAOC基因在幼茎和开花期的叶中表达较强;TfAOS基因在幼叶和开花期的茎中表达最强,而在幼茎和花期叶中不表达。TfLOX、TfAOS和TfAOC基因在胚囊发育的所有时期都有表达,表达水平差异较大。TfLOS基因在八核期、七细胞期和雄蕊中表达较强;TfAOS基因在四核期、七细胞期和成熟期表达较强;TfAOC基因在大孢子期、二核期和雄蕊中表达较强。3个基因在子房中的表达水平比花柱中高。  采用His·BindResinNi-charged亲和层析柱纯化的pET-32a-TfAOC融合蛋白免疫SD大鼠与新西兰大白兔,成功制备了效价较高的抗血清,ELISA酶联免疫检测其效价高于1:6000,Westernblot显示抗体与不同时间诱导以及纯化后的目的蛋白都能出现杂交信号。为了研究TfAOC基因在蓝猪耳有性生殖中的功能,利用制备的抗体通过免疫荧光技术对TfAOC蛋白在蓝猪耳雌蕊中的位置进行了研究,我们推测TfAOC蛋白主要存在于胚珠的珠心和合点,或者花柱和胎座中的维管束上。  通过中间载体pSK+int引入一段内含子间隔区,TfAOC的RNA干扰片段经过多次的酶切和连接过程最终连入表达载体pCAMBIA1303中形成ihpRNA结构,PCR及双酶切鉴定结果显示:构建的RNA干扰载体的ihpRNA结构完整。采用冻融法将表达载体转入农杆菌EHA105中,通过叶片外植体与农杆菌共培养进行愈伤组织和不定芽诱导,目前得到了幼小的抗性植株。
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