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目的:采用融合表达方式获得无需复性的点突变重组人β干扰素-1b(17Ser-IFN-β-1b),并通过PEG修饰制备PEG-β-IFN-1b。 方法:通过PCR技术获得含有不同蛋白酶酶切识别位点的基因序列,分别构建重组表达载体pET-32a-EK-β-IFN-1b、pET-32a-TEV-β-IFN-1b、pET-32a-thrombin-β-IFN-1b。然后转化表达菌Origami DE3表达融合蛋白,经纯化回收的融合蛋白分别用相应的蛋白酶酶切,根据融合蛋白的酶切效率和酶切特异性,筛选制备重组人β干扰素-1b的工程质粒和工程菌。酶切后的融合蛋白经反相C18精纯化,获得高纯度的重组人β干扰素-1b,并进行PEG修饰,制备单一的修饰产物,通过Wish/VSV法测定其抗病毒比活性。 结果:成功构建了含单一蛋白酶切位点的重组载体 pET-32a-EK-β-IFN-1b、pET-32a-TEV-β-IFN-1b、pET-32a-thrombin–β-IFN-1b,经DNA测序正确。重组质粒转化表达菌Origami DE3构建的工程菌,经诱导表达的融合蛋白占菌体总蛋白的20％以上。破菌后纯化回收的融合蛋白通过相应的蛋白酶酶切筛选,最终选择pET-32a-EK-β-IFN-1b作为重组工程质粒,pET-32a-EK-β-IFN-1b/Origami DE3作为重组工程菌。Ni柱亲和纯化回收的融合蛋白,EK酶酶切效率不低于90%。制备的重组人β干扰素-1b纯度高达98%以上,质谱分子量与理论值一致。制备的PEG-β-IFN-1b的纯度达到90%以上。测活结果显示,制备的重组人β-IFN-1b的抗病毒比活性为4.5×107IU/mg,其PEG修饰后比活性为5.6×106IU/mg。 结论:成功地构建和筛选了融合表达重组人β-IFN-1b的工程菌。制备的重组人β-IFN-1b具有治疗多发性硬化症或肝炎的潜在价值。