目的：　　 实验一:随着外科手术、免疫抑制药物、胰岛分离纯化技术的迅速发展，胰岛移植已成为治疗糖尿病的理想途径之一。然而目前在胰岛分离纯化过程中仍然没有一种专门用于胰岛分离纯化分离液，应用UW液等器官保存液仍然面临着纯化效率低下，胰岛保护作用差等问题，因此，目前迫切需要研发一种分离效率高、胰岛保护作用强、成本低的胰岛分离液。在总结国内外器官保存液的仇缺点后，我们结合胰岛细胞能量代谢特点并遵循器官保存液配制的原则，我们成功配制了一种新型的胰岛分离液。本实验对该胰岛分离液与Optiprep配合形成的不同密度的梯度密度分离液在小鼠胰岛分离中的分离效率及胰岛保护作用进行了研究，并与UW液与Optiprep组成的梯度密度分离液进行了对比。　　 实验二:胰岛细胞具有高度的代谢活性，胰岛移植后的无血管期及后期的血管形成不良是造成胰岛丢失进而导致胰岛移植低效性与短效性的重要原因之一，因此通过相应策略加快移植后胰岛周围新生血管生成并增加血管密度成为了近期胰岛移植领域研究的热点。目前已有部分文献报道了MSCs可以促进移植胰岛周围新生血管的生成。然而仍有许多内容值得深入探讨。1.目前研究中的糖尿病模型仅为STZ的诱导模型，不能很好的模拟糖尿病的发病及免疫机理。2.移植受体为同基因或免疫缺陷受体，虽避免了免疫耐受的诱导及移植后的免疫排斥，但不能真实的反应MSC的治疗效果。3.目前MSCs都是通过与胰岛混合后共同移植于肾被膜下，MSCs能否通过趋化归巢特性迁移到胰岛移植部位来发挥其相应作用尚未有文献证明。4.MSCs在体内与胰岛联合移植后能否分化为血管内皮或平滑肌细胞尚未获得公认。因此本实验拟采用自发糖尿病模型小鼠，通过骨髓移植及应用免疫抑制剂诱导免疫耐受，之后给予同种异体胰岛移植并经静脉途径联合MSCs移植，来探讨MSCs对移植胰岛功能及移植后新生血管形成的影响及其机制。　　 方法：　　 SPF级BALB/c小鼠（4周龄）、SPF级BALB/c小鼠（8-12周龄）、SPF级NOD/Lt小鼠（8-12周龄）均购自北京华阜康生物科技股份有限公司。　　 胰岛分离纯化:应用1％异氟醚麻醉BALB/c小鼠后，V字型切开小鼠腹壁，在胆总管末端进行结扎，经左右肝管汇合处进针，注入含有2mg/ml胶原酶的消化液，使胰腺膨胀，之后切取胰腺。将胰腺置于37℃的水浴中消化10分钟。将消化后的胰腺进行连续梯度密度离心纯化胰岛。　　 胰岛移植:对梯度密度离心纯化后的胰岛进行人工挑选进行二次纯化，将纯度达到99％的胰岛转移到PE50管中并离心沉降。糖尿病小鼠麻醉后，在左侧肋下取斜切口暴露肾脏，在肾脏下极划破肾被膜，再将装有胰岛的PE50管插入肾被膜下植入胰岛，缝合切口。　　 骨髓细胞提取及输注:切取BALB/c小鼠的后腿，清除所有肌肉组织，用剪刀剪断干骺端暴露骨髓腔，用带有26号针头的20ml注射器吸取PBS后冲洗骨髓腔。骨髓细胞经冲洗、裂解红细胞后计数，调整细胞浓度为2×108/ml，之后将0.3ml细胞悬液(即6×107)经尾静脉输注到NOD/Lt小鼠体内。　　 骨髓多能间质细胞提取:以骨髓细胞提取相同的方法收集BALB/c小鼠骨髓细胞。不经红细胞裂解直接向骨髓细胞中加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基并转入培养瓶培养。每日换液直至细胞达到90％密度时，用0.25％胰酶消化并传代。经2次传代后骨髓多能间质细胞可达到99％纯度。此时可收取细胞并进行移植。　　 免疫耐受诱导:在行骨髓移植前3天将1×108剂量BALB/c小鼠脾细胞经尾静脉输注到NOD/Lt小鼠体内。骨髓移植前一天给予200mg/Kg单剂量环磷酰胺腹腔注射。骨髓移植当天给予6×107中等剂量骨髓干细胞移植，同时开始应用MR1联合抗BTLA单抗治疗，抗-CD154单克隆抗体MR10.5mg每日腹腔注射至术后第5天，之后于第7、10、14天给予MR1;抗BTLA单抗移植当天0.5mg腹腔注射，之后0.25mg于第2、4、6、8及10天腹腔注射。　　 实验一:消化后的胰腺按体积平均分为两组，分别应用IPS-Optiprep液及UW-Optiprep液进行连续梯度密度离心纯化胰岛。胰岛分离纯化前后分别从两组组织悬液中吸取50ul悬液各3次，通过双硫腙将胰岛染色，完成计数及纯度、完整度、回收率检测，之后通过FDAPI来分析纯化后胰岛的活性，对比两种分离液的纯化效率及胰岛保护效果。最后将200IEQ胰岛移植入STZ诱导糖尿病BALB/c小鼠左侧肾被膜下，每日监测血糖水平，并在术后第21天完成腹腔糖耐量检测，对比两种分离液纯化胰岛的在体活性及功能。　　 实验二:骨髓细胞移植前3天应用脾细胞行NOD鼠尾静脉注射，单剂环磷酰胺(200mg/kg)于骨髓干细胞移植前1天腹腔注射，骨髓细胞移植当天行60million/鼠中等量骨髓细胞移植。骨髓干细胞移植当天，抗-CD154单克隆抗体MR10.5mg每日腹腔注射至术后第5天，之后于第7、10、14天给予MR1;抗BTLA单抗移植当天0.5mg腹腔注射，之后0.25mg于第2、4、6、8及10天腹腔注射。骨髓细胞移植术后2周，实验组行MSCs与胰岛左肾被膜下联合移植治疗糖尿病NOD鼠。对照组1仅行胰岛细胞移植;对照组2仅行MSCs移植。术后监测NOD鼠血糖变化及糖耐量变化，了解移植物生存等情况。骨髓细胞移植后每周检测外周血淋巴细胞细胞嵌合体水平。术后2、4、8周切取移植侧肾脏检测移植胰岛的再血管化、胰岛再生及凋亡情况，并检测MSCs是否分化为血管内皮细胞或平滑肌细胞，检测MSCs分泌VEGF及HGF情况。　　 结果：　　 实验一:IPS液具有良好的胰岛分离效率，它提高了胰岛的纯度与回收率。实验中我们还发现应用UW纯化后的胰岛中混有较多未被消化的毛细血管，这些毛细血管片段极易粘附胰岛，不仅降低了胰岛的纯度还增加了之后人工挑选过程的难度，而应用IPS液则明显的减少了毛细血管片段的含量。此外IPS液更好的保护了胰岛的形态，并且提高了胰岛的完整度。我们分析这可能与加入乌司他丁有关，因为乌司他丁能起到保护胰岛避免受到破损的外分泌细胞释放出的蛋白酶的破坏的作用。在胰岛活性方面，应用IPS液纯化的胰岛的活性较UW液差，其机制并不清楚，我们猜测可能与IPS液内含有较多的内毒素有关。将应用两种保存液纯化后的胰岛同体移植于STZ诱导的糖尿病小鼠后，两组中所有小鼠的血糖均恢复到了正常水平，且均可维持30天，并未显现出胰岛功能方面的差异。在价格方面，IPS液具有明显的优势，显著的降低了分离成本。　　 实验二:MSCs与胰岛联合移植与单独胰岛移植组均能明显改善移植后小鼠的血糖水平，治疗成功率达到100％。而MSCs单独移植组糖尿病小鼠的血糖并未得到改善，且MSCs并未向胰岛细胞转化，单独进行骨髓多能间质细胞移植并不能达到治疗糖尿病的目的。MSCs联合移植可促进胰岛移植后的再生，减少胰岛移植后的凋亡。胰岛移植后2、4、8周，MSCs联合移植组移植胰岛周围血管密度均明显多于单独胰岛移植组。MSCs联合移植明显增加了NOD小鼠的嵌合水平。嵌合率的增高可以加强同种异体胰岛移植物的嵌合、增强其免疫耐受，进而保护胰岛的功能及活性。MSCs可以迁移到胰岛移植部位，并可以转化为血管平滑肌细胞或血管内皮细胞以及分泌VEGF因子。由此增加了移植胰岛的血供、改善了胰岛的代谢活性，保护了移植胰岛的功能与活性。　　 结论：　　 实验一:我们综合各种器官保存液的优缺点设计的这种新型胰岛分离液在胰岛分离提纯中与UW液相比显示出更好的分离效率，增加了胰岛的纯度、完整度与回收率，并明显的降低了纯化成本。在对胰岛功能保护方面与液与UW液相当，然而对胰岛细胞活性的保护却不及UW液。　　 实验二:本实验在采用与人糖尿病发病机制相似的糖尿病NOD小鼠、通过骨髓移植及应用免疫抑制剂诱导免疫耐受之后，完成同种异体胰岛移植并联合静脉途径MSCs移植。证明了MSCs可以迁移到移植胰岛周围并通过转化为血管平滑肌细胞或血管内皮细胞以及通透分泌VEGF因子来促进移植胰岛周围新生血管生成，由此增加了移植胰岛的血供，保护了移植胰岛的功能与活性。MSCs还可以通过增加NOD小鼠的嵌合水平来增强同种异体胰岛移植物的免疫耐受，进而保护胰岛的功能及活性。此外，在本实验中我们还发现MSCs并未转化为胰岛素分泌细胞，单独进行骨髓多能间质细胞移植并不能达到治疗糖尿病的目的。