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产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)所引起的仔猪腹泻率高达30%～50%,给养殖生产造成了巨大的经济损失。ETEC主要通过菌毛黏附素定植在肠道表面,通过释放肠毒素,引起仔猪脱水性腹泻,菌毛黏附素与肠上皮细胞的特异性结合是致病的首要因素。F4和F18是导致仔猪腹泻的主要ETEC菌株,其黏附素FaeG和FedF在定植中发挥着主要作用。菌毛黏附素主要由蛋白质组成,具有良好的免疫原性。有研究表明,通过体外表达ETEC菌毛黏附素来免疫仔猪,对预防致病菌引起的腹泻具有良好的效果。本研究主要通过构建黏附素与分子伴侣GroEL/GroES共表达体系来获得黏附素的可溶性表达,进一步优化发酵条件来提高黏附素可溶性表达产量,为规模化制备有活性的黏附素抗原提供可能,并探讨重组黏附素蛋白的免疫原性及制备的多克隆抗体的特异性。第一部分F4和F18黏附素与分子伴侣GroEL/GroES共表达载体构建结果如下:以F4ac标准菌株C8371及F18ac标准菌株2134P为试验材料,将PCR扩增得到的FaeG1-262序列及主要参与黏附过程的FedF15-165序列构建于pET表达载体上,将表达载体与分子伴侣GroEL/GroES载体pGro7共转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中,经Western blotting检测,共表达体系成功表达了目的蛋白。通过对共表达体系与单独表达体系蛋白表达水平的比较发现,FaeG蛋白可溶性表达水平提高了 18%,包涵体表达量减少44%;FedF蛋白可溶性表达水平提高了 58%,包涵体表达量无明显差异,由此可见共表达体系提高了 FaeG和FedF蛋白的可溶性表达水平。黏附素蛋白带有6*HIS标签,以此进行镍亲和层析纯化,获得了纯度高达90%的黏附素蛋白,为后续免疫试验提供了良好的抗原。对纯化的蛋白进行MALDI-TOF-MS质谱分析,结果显示,表达的FaeG和FedF蛋白氨基酸序列与天然蛋白序列分别达到72.5%和69.5%的一致性,对纯化蛋白进行圆二色谱分析表明,黏附素蛋白形成了正确的蛋白空间构象。第二部分重组工程菌可溶性表达发酵条件优化结果如下:1、对种龄、诱导温度、诱导时间、IPTG诱导浓度、L-阿拉伯糖诱导浓度进行单因素优化。通过分析各因素水平对菌体生长的影响,结合Quantity one4.6.2软件分析破碎菌体液SDS-PAGE电泳条带,计算黏附素蛋白可溶性表达量的灰度值,对不同条件下目的蛋白可溶性表达量进行相对比较,选择各因素最佳水平。优化结果如下,BL21(FaeG)菌株最适种龄为10h,诱导时间24h,诱导温度18℃,IPTG诱导浓度0.3mmol/L,L-阿拉伯糖诱导浓度0.8g/L,目的蛋白上清中浓度达到37.3mg/L,比未优化前(4.4mg/L)提高了 8倍。BL21(FedF)菌株最适种龄为1Oh,诱导时间24h,诱导温度1 8℃,IPTG诱导浓度0.1mmol/L,L-阿拉伯糖诱导浓度0.8g/L,目的蛋白上清中浓度达到12.2mg/L,而未优化上清中几乎无目的蛋白。2、通过单因素试验筛选适合的碳源、氮源种类及适合的添加浓度以及最佳的磷酸盐浓度。分析方法同可溶性发酵条件优化试验,最终得到BL21(FaeG)最适培养基成分为葡萄糖10g/L、酵母粉18g/L、蛋白胨9g/L、磷酸二氢钾72mmol/L磷酸氢二钾17mmol/L,FaeG蛋白优化后可溶性表达量达到60.36mg/L,比优化前(41.26mg/L)提高了 1.46倍。BL21(FedF)最适培养基成分为葡萄糖30g/L、酵母粉12g/L、蛋白胨6g/L、磷酸二氢钾36mmol/L、磷酸氢二钾8.5mmol/L,FedF蛋白优化后可溶性表达量达到21.78mg/L比优化前(15.9mg/L)提高了 1.37倍。3、以摇瓶发酵优化结果为基础,采用变速补料的方式对重组工程菌进行高密度发酵培养,根据菌体生长的阶段性,流加不同浓度的葡萄糖,保持培养基中低残糖浓度(<3g/L),通过控制通气量及转速保证溶氧水平维持在30%左右。最终菌体浓度均达到12g(DCW)/L以上,FaeG蛋白可溶性表达量达到536mg/L,FedF蛋白可溶性表达量达到357mg/L,分别比摇瓶水平提高了 9倍和15倍。第三部分多克隆抗体制备结果如下:以纯化的黏附素蛋白为抗原免疫新西兰雄兔,四次免疫后收集血清,采用间接ELISA的方法测定血清效价。以FaeG蛋白为抗原的血清效价达到1:320000,以FedF蛋白为抗原的血清效价达到1:40000,表明获得的两种多克隆抗体均具有很高的抗体效价。通过免疫印迹的方法来检测该血清抗体的特异性,分析表明,免疫阳性血清在目的蛋白处形成明显条带,而免疫前阴性血清未出现条带,证明FaeG和FedF重组蛋白均能与兔抗阳性血清发生明显的特异性抗原抗体反应。综上所述,通过分子伴侣GroEL/GroES辅助表达及发酵条件的优化显著提高了黏附素蛋白的可溶性表达水平,在一定程度上克服了大肠杆菌形成包涵体的缺陷,为规模化制备有活性的黏附素抗原提供了可能。以F4和F18黏附素为免疫原制备的多克隆抗体具有极高血清效价及免疫特异性,为预防仔猪腹泻提供了一种替代抗生素的可行治疗方式。