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果实品质性状形成机理是农业科学中的一个难点,也是高等植物发育中的一个重要问题。果皮是果实品质性状形成的基本要素,与果皮发育相关的果实大小、外观色泽、成熟采收期和保鲜耐贮性等均是水果的重要商品性状之一。迄今为止,与荔枝果皮发育相关的分子生物学研究鲜见报道,特别是功能基因与性状表现分子机理的探索仍然匮乏。构建cDNA文库并进行生物信息学分析,既可揭示荔枝果实品质性状形成的分子机理,又可大大促进以品质改良为目标的分子育种进程。
本研究主要是通过构建荔枝果皮发育两个关键时期(细胞分裂盛期和细胞膨大期)cDNA文库,开展多路径生物信息学分析,查询分析出发育相关的功能基因为获得果皮发育相关功能基因提供线索。获得如下结果:
(1)成功获得荔枝果皮发育两个关键时期(细胞分裂盛期和细胞膨大期)高质量cDNA文库。细胞分裂盛期文库库容2×106Pfu ml-1,重组率92.4%,重组片段的平均长度约1kb,冗余率43.31%;细胞膨大期文库库容3×106 Pfu ml-1,重组率90.9%,重组片段的平均长度约1kb,冗余率49.8%。文库各项指标表明文库的质量合格。
(2)分别在两个文库中随机挑选3000单克隆样品测序,获得了1353和1331条Unigene,对Unigene序列进行了ORF预测,功能注释,功能分类等高级生物信息学分析,确定这些Unigene序列分别为308和387个同源基因。
(3)通过比较两个时期基因表达丰度,发现vegetative storage protein(VSP1)、Metallothionein-like protein(MT45)和26S-ribosomal RNA gene三个基因在细胞膨大期特异优势表达,这三个基因在荔枝果皮细胞膨大期的发育过程应有关键作用。
(4)荔枝果皮的发育,是一个复杂的调控过程,其中内源植物激素的调节起到决定性的作用。因此,本文根据以上生物信息学分析结果,对注释的基因进行文献检索,重点对内源植物激素代谢关键酶和调节信号通路中的关键组分等基因序列的功能进行分析,获得了如下相关功能基因ESTs:生长素(Skp1、AUX/IAA、ARF、SAUR family protein)、细胞分裂素(tRNA delta(2)-isopentenylpyrophosphate transferase)、赤霉素(Ent-kaur synthase、Copalyl pyrophosphate synthase、GGPP synthase gene、DELLA、gasa4)、油菜素内酯(BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-associated receptor kinase 1)和乙烯(MAT、ACS、ACO、ETR-FAMILY、CTR、RAF-like kinase、SCF complex、ERFI(EREBP)、EIN3 transcription factor)等内源植物激素合成和信号调控相关的部分基因,以及钙调蛋白信号通路组分基因(calmodulin-binding、Calmodulin、calcium-binding EF hand family protein、CRT1(CALRETICULIN1)、calcium ion binding、calreticulin)。并对这些基因如何调节进行分析预测,并画出调节网络图。这些基因可能通过植物激素代谢及其激素调节信号途径来影响荔枝果皮细胞的增殖和膨大。
(5)通过对注释ESTs的功能检索与分析,本文还分析出了包括P21、14-3-3、14-3-3d、Dual specificity phosphatase Cdc25、DNA polymerase subunit Cdc27、Serine/threonine-protein kinase、Calcyclin-binding promin、HMG、Stromal cell-derived factor 2-like promin等与细胞增殖相关的基因;aquaporin1(PIP1)、aquaporin 2(PIP2))、Pectinesterase、XCP2、cellulose synthase、Cellulose synthase A catalytic subunit6、xyloglucan endotransglycosylase3(XET3)mRNA、xyloglucan endotransglycosylase 2(XET2)、expansin1、expansin2等调控和参与细胞膨大相关基因ESTs。在细胞膨大期文库中还获得了抑制分生区细胞增值的(CLAVATA)基因ESTs,CLAVATA基因的沉默能有效地增加茎尖的分生组织(SAM),这或许是荔枝果皮发育明显划分为两个时期(细胞分裂盛期,和细胞膨大期)的生理基础。
上述功能基因的分析,为进一步基因功能鉴定与利用,改良荔枝果实大小、抗裂、耐贮性等品质性状的分子育种与基因工程,均奠定了良好的分子生物学基础。