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1、背景与目的:cyclophilin A(CypA)是CyP家族中发现最早且研究最多的,多项研究表明其与肿瘤关系密切,在多数肿瘤中呈上调表达,前期实验曾通过酵母双杂交的方法筛选出可能与CypA相互作用的蛋白,ARL6IP4(SR-25)是其中克隆数较多的一个,并且ARL6IP4与mRNA剪接相关。本实验旨在验证CypA与ARL6IP4之间是否确实存在相互作用。
2、方法:培养Hep3B细胞,参照脂质体转染试剂盒步骤将CypA、ARL6IP4转染进Hep3B细胞,48h后收集细胞,提取蛋白,western blot检验CypA和ARL6IP4在细胞中的表达。然后通过荧光共定位观察两者在Hep3B细胞中的定位,观察定位点是否有重叠,为进一步验证两者之间是否存在相互作用提供基础。免疫共沉淀实验旨在观察Flag-CypA是否可以被Myc-ARL6IP4“拉”下来,从而得以在体外实验中验证两者之间是否存在相互作用。
3、结果:western blot实验表明CypA与ARL6IP4可在肝癌细胞中表达。荧光共定位结果证明两者都定位于Hep3B细胞的细胞核中,且两者在细胞中的定位点有很好的重叠;免疫共沉淀实验结果表明CypA可以被ARL6IP4“拉”下来,从而表明CypA与ARL6IP4之间存在相互作用。
4、结论:体外实验表明CypA-q ARL6IP4在细胞中有共同的位点,且存在相互作用。