放线菌NO.339代谢物活性成份分离提取及生物活性研究

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本文对放线菌NO.339代谢物活性成份分离提取及生物活性进行了研究。放线菌NO.339产生的次级代谢产物对东方粘虫具有杀虫活性,对次级代谢产物中的活性组分进行分离提取。测定分离纯化出来的样品的致死中浓度LC50以及其细胞毒性方面的研究。首先对放线菌NO.339的发酵工艺进行优化,确定最佳的发酵培养基和发酵条件。利用这些优化的条件,对放线菌NO.339进行发酵,对活性成份进行分离提取。离心处理获得的上清液用乙酸乙酯萃取,菌丝体用80%的乙醇浸泡,将两部分样品合并获得粗品。利用硅胶柱层析、薄层层析、高效液相色谱分析和制备,获得两个活性组分NO.339-Ⅰ和NO.339-Ⅱ。NO.339-Ⅰ纯度为93.7%,组分NO.339-Ⅱ纯度为95%。将获得的两个组分分别进行生物活性测试,测定组分NO.339-Ⅰ对东方粘虫的致死中浓度LC50约为7.809μg/ml,组分NO.339-Ⅱ对东方粘虫的致死中浓度LC50约为2.451μg/ml,NO.339-Ⅱ的杀虫活性高于NO.339-Ⅰ的杀虫活性。对样品进行细胞毒性方面的研究,包括细胞活力、细胞凋亡、DNA损伤以及对caspase-3,caspase-9酶活影响的测定。通过MTT测定活性组分对细胞活力的影响,测得NO.339-Ⅰ的IC50约为17.78μg/ml,NO.339-Ⅱ的IC50约为8.89μg/ml。通过AO/EB染色的方法测定这两个活性组分均能够诱导Sf9细胞凋亡,并且随着药物浓度的增加,细胞凋亡也随之增加,且NO.339-Ⅱ诱导能力优于NO.339-Ⅰ。通过彗星电泳测定这两种活性组分均能引起DNA损伤,并且两种活性物质浓度越高,DNA损伤程度越大,NO.339-Ⅱ对Sf9细胞的DNA损伤程度大于NO.339-Ⅰ。使用酶标仪检测两种活性组分对细胞凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-9酶活的影响,这两种活性组分促使Sf9细胞中的细胞凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-9被活化,浓度越高,活化的程度越大,并且NO.339-Ⅱ的活化程度均高于NO.339-Ⅰ。
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