NF-κB靶基因谱及其调控网络的研究

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核转录因子NF-κB是一类可调控大量基因的表达,并在众多细胞中广泛表达的转录因子。NF-κB是机体免疫应答和炎症反应的重要调节因子,同时也参与许多重要的生物过程的调控,多种疾病的发病机制与NF-κB的异常活化有关。因此,NF-κB具有重要的科研和医学价值,是当前进行转录治疗药物开发的一个重要靶点。针对NF-κB过度活化而开发的活性抑制性分子具有降低或消除NF-κB过度活化的药用价值,但同时也有可能对NF-κB的正常功能带来伤害,从而产生毒副作用。为了防止这种情况的出现,对NF-κB的完整而确切的生理功能的研究成为该领域的热点。其中研究重点是发现并鉴定NF-κB在全基因组中的所有DNA结合位点及靶基因。根据这些DNA结合位点及靶基因所发挥的分子功能及参与的生理过程,才能弄清楚NF-κB的功能全貌。由于NF-κB是典型的诱导型的转录因子,不同细胞在不同刺激物作用下NF-κB的调控网络及其直接靶基因谱是不同的,因此研究其完整的靶基因谱及其调控网络是很困难的。当前研究转录因子体内结合特征的主要实验技术是染色质免疫沉淀技术(ChIP)。与ChIP-chip技术相比较,ChIP-seq技术是能真正实现在全基因组范围内鉴定转录因子体内结合谱和进行表观遗传分析,进而可揭示活体细胞内基因表达调控规律和为构建基因表达调控网络模型提供实验数据。在ChIP-seq实验中,由于染色质压缩程度的不均匀性、DNA打碎、PCR扩增的偏向性(Bias)、基因组中序列的冗余性以及测序过程都会引入错误而造成假阳性;转录因子与DNA间的间接结合也会增加噪声;因此,必须通过统计方法去除噪声,才能准确地获得"峰"的信号。由于ChIP-seq技术是对目的DNA片段进行直接测序而不用与在芯片上的探针进行杂交,因此具有更少的扩增错误(artifacts)、更高的分辨率、覆盖率及更广的应用范围。ChIP-seq技术现已是功能基因组学领域研究的重要前沿技术;但其带来的海量数据及其高度复杂性也向生物信息学研究人员提出了严重的挑战。本论文主要研究内容包括:1.应用ChIP-seq、RNAi和基因表达谱技术鉴定人HeLa细胞在TNF-α刺激下NF-κB的直接靶基因。活化的NF-κB首先与体内特异性DNA序列结合开始调控其靶基因的表达。因此,研究其在整个基因组范围内的结合特征,这对于鉴定它所有的靶基因及解释对转录复合体和多样化转录调控的影响是非常重要的。结果鉴定出266个激活和318个抑制的NF-κB靶基因,其中50%和90%的基因在拥有它们的ChIP Peak中包含经典和非经典的κB位点模体(Motifs)。在本研究鉴定的靶基因中,只有很少数量的靶基因同在其它细胞类型中鉴定的靶基因重叠,进一步证明该因子很多的靶基因具有细胞和诱导剂特异性。这些数据证实不同类型细胞对不同刺激物反应中不同的靶基因具有高度的选择性调控。本研究发现虽然大量基因(13600)在TNF-α刺激的HeLa细胞中与NF-κB结合,然而,这些基因中只有4.3%(584)的基因转录受到显著调控。人基因组中这种大量有潜力的靶基因可为NF-κB提供多样化的不同靶基因及靶基因的选择性调控;因此,NF-κB的功能和调控具有很大的复杂性和多样性,而这对促进NF-κB靶基因的多样化和高度选择调控是很重要的。同时发现NF-κB表现出很多显著的体内结合特征,如:在不同的染色体间NF-κB具有不同的结合强度;高度大于20的Peak在染色体内的分布并不平均,与染色质的状态有关;NF-κB在体内更多地与内含子区结合;NF-κB通常与其靶基因进行多位点结合;NF-κB体内结合位点更多的是非经典κB位点占据它的靶基因,而不是经典κB位点;NF-κB在人基因组中具有很大的基因覆盖度。体内全基因组结合特征影响直接靶基因的转录,这反映了参与很多生物过程以及对各种内外界刺激的应答的诱导型转录因子的某些重要的特征。2.通过手工信息检索及本实验室已有的数据组建了目前收录最完整的、准确的及包含有具体实验信息的NF-κB靶基因数据库(http://tfdb.seu.edu.cn/nfkb/)。NF-κB是典型的诱导型转录因子,在不同的细胞中,使用不同的诱导剂表达调控的靶基因谱是不同的。本数据库包含了 2267个NF-κB直接靶基因,去除重复的靶基因后为1667个NF-κB直接靶基因,同时收集了鉴定靶基因时所用的诱导剂,细胞类型,实验方法,及转录因子在体内的结合区域,即PCR扩增区域或染色质免疫沉定区域的具体序列及所含有的NF-κB体内十种结合模体的具体数目等信息。本数据库提供的数据有助于更好地理解真核生物基因表达调控网络,具有重要的基础科研价值。3.对收集的NF-κB靶基因进行GO功能和KEGG分析。结果表明,NF-κB是癌症,细胞凋亡,Jak-STAT,异体排异等多种重要通路和应激反应的中心调节子;同时,也是人体免疫应答的中心调节子;参与人体的骨病,寿命,慢性阻塞性肺疾病,全身性红斑狼疮,多发性硬化病,心肌梗塞等多种疾病的发生,其经典靶基因参与多种癌症的发生,是治疗疾病的靶点。许多病原体和病毒能激活NF-κB,说明NF-κB是一个进化保守的免疫和炎症调节子。而且,NF-κB是细胞代谢过程的中心调节子,共有608个NF-κB靶基因参与到各种细胞代谢过程;在由代谢紊乱引起的疾病中起重要的作用,如心血管疾病和糖尿病。由于有98种转录因子是NF-κB的靶基因,因此NF-κB在生物体的转录调控网络中起重要的作用。诱导剂类型通常可决定NF-κB靶基因的表达是上调还是下调。4.建立了 NF-κB靶基因在HeLa细胞和THP-1细胞中基因调控网络图及NF-κB的MicroRNAs(miRNAs)靶基因的表达调控网络图。尽管在HeLa细胞和THP-1细胞中鉴定的NF-κB靶基因只有39个相同的基因,但NF-κB在HeLa细胞和THP-1细胞中的生物功能是相似的。miRNAs作为基因表达转录后水平的调节子,可调节很多基因的表达,组成了一个对生命体具有重要意义的基因表达调节层次;同时在NF-κB信号通路中发挥重要的作用。miRNAs的异常调节经常伴随着肿瘤的产生与发展,在不同的肿瘤和癌细胞中,miRNAs既可作为致癌基因也可作为肿瘤抑制物,因此,miRNAs可作为癌症的治疗靶点。NF-κB通过调节miRNAs靶基因的表达量,形成每种细胞的先天性和后天性免疫系统所具有独特的miRNAs表达谱,具有细胞类型特异性;并在细胞发育、功能和表观遗传学中起重要的作用。
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