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目的:慢性肾脏病（Chroinc kidney disease,CKD）已经成为了危害人类健康的全世界公共卫生和健康问题。近年来,我国慢性肾脏病发病率呈现出上升的趋势。反复的检查和治疗不仅给患者增加了身体上的痛苦,更是带来了巨大的经济和心理上的压力,降低了生活质量。肾间质纤维化是公认的慢性肾脏病发展至终末期肾脏病的标志。以往研究已证实,肾小管上皮细胞-间质转分化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）,是促成肾间质纤维化（Renal interstitial fibrosis,RIF）进程的重要原因之一。EMT即参与机体正常的生长,也与很多疾病过程相关,在其中发挥了重要作用。如胚胎发育,慢性炎症疾病,组织重塑,癌细胞转移以及多种纤维化疾病。生长抑制因子家族（Inhibitor Of Growth Family Members,INGs）是一组抑癌基因,包括ING1ING5这5个家族成员,其中生长抑制因子4（Inhibitor Of Growth Family Members,ING4）作为INGs的重要一员,对肿瘤细胞的生长、转移、浸润的抑制及对细胞凋亡的促进等发挥着重要作用。近年来有研究发现,ING4涉及多种疾病,不仅能抑制肿瘤细胞的EMT过程,且与肺纤维化参数呈负相关。然而,ING4在肾脏纤维化疾病及肾小管EMT中的作用仍然是未知的。本课题首先进行大鼠肾脏单侧输尿管结扎,建立UUO模型,研究ING4与肾小管间质纤维化的关系。然后采取低氧条件诱导人肾小管上皮细胞（HK2细胞）发生EMT,探讨ING4与低氧诱导的肾小管EMT的关系。最后探讨ING4影响低氧诱导肾小管发生EMT可能的机制。研究方法:首先,将SD雄性大鼠随机分成肾间质纤维化组（UUO-L组）及对照组（Control-NL组）,每组各6只。UUO-L组大鼠行左侧输尿管结扎手术,之后缝合腹膜及皮肤,Control-NL组大鼠仅进行左侧输尿管游离、不结扎,之后直接缝合腹膜及皮肤。手术14天以后将大鼠处死,留取大鼠左侧肾组织,用PBS冲洗,再用4%多聚甲醛固定,之后制作切片。HE染色法检测肾组织病理学变化。Masson三染检测肾组织胶原蛋白表达情况。免疫组织化学染色（Immunohistochemical staining,IHC）检测肾组织中ING4、低氧/缺氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）表达部位。Western blot法测定大鼠肾组织中N-钙黏蛋白（N-cadherin,N-cad）,波形蛋白（vimentin）以及E-钙黏蛋白（E-cadherin,E-cad）的表达程度。Quantitative Real-time PCR（q RT-RCR）和Western blot分别检测肾组织中ING4和HIF-1α的m RNA及蛋白表达水平。明确当肾脏发生间质纤维化时,ING4及HIF-1α水平是否发生变化,以及UUO模型内是否存在低氧环境。其次,将HK2细胞分为两组（即:（1）normoxia:常氧组;（2）hypoxia:低氧组）,分别在常氧、5%O2低氧条件下培养24小时。之后拍摄细胞形态,MTT法检测细胞活力的变化,Western blot检测两组细胞中E-cad、vimentin及N-cad的蛋白水平,免疫荧光检测细胞中N-cad表达情况,q RT-RCR检测细胞中胶原蛋白I（Collagen I）、胶原蛋白IV（Collagen IV）、ING4的m RNA水平,Western blot检测细胞中ING4的蛋白表达程度。根据以上结果判断低氧条件下HK2细胞是否发生EMT,以及在常氧、低氧两种条件下HK2细胞ING4表达水平是否发生变化。根据基因序列,构建ING4过表达质粒,转染至HK2细胞,q RT-RCR检测ING4 m RNA转录水平,Western blot方法检测ING4蛋白表达程度,验证过表达效果。证明ING4过表达质粒转染细胞成功后,将HK2细胞分为四组（即:（1）normoxia:常氧组,（2）hypoxia:低氧组,（3）vector+hypoxia:空载+低氧组,（4）ING4+hypoxia:ING4过表达+低氧组）,于常氧或5%O2低氧条件下接着培养24小时,然后用q RT-RCR检测细胞中Collagen I、Collagen IV m RNA转录水平,Western blot检测HK2细胞中N-cad,vimentin及E-cad三者的蛋白表达水平,免疫荧光法检测HK2细胞N-cad表达情况。通过以上结果观察过表达ING4对低氧诱导的HK2细胞EMT过程的影响。最后,HK2细胞中加或不加二甲基乙二酰基甘氨酸（Dimethyloxallyl Glycine,DMOG）（该试剂是一种HIF羟化酶抑制剂,可以使HIF-1α稳定表达,起到HIF-1α激活剂的作用）,将细胞分为四组（即:（1）vector+hypoxia:空载+低氧组,（2）ING4+hypoxia:ING4过表达+低氧组,（3）vector+DMOG+hypoxia:空载+激活剂+低氧组,（4）ING4+DMOG+hypoxia:ING4过表达+激活剂+低氧组）,于5%O2低氧环境下继续培养24小时,然后q RT-RCR检测四组细胞中collagen I和collagen IV m RNA的水平,Western blot检测E-cad、N-cad和Snail的蛋白水平。目的在于观察在低氧条件下,过表达ING4影响HK2细胞EMT过程的机制。结果:1、HE染色结果显示:UUO-L组表现为肾小管扩张,肾小管上皮细胞肿胀,呈空泡样变,重者萎缩;肾间质水肿,可见炎性细胞浸润。Masson染色结果显示:UUO-L组肾脏组织中蓝染的胶原纤维明显多于control-NL组。UUO-L组E-cad表达低于control-NL组（p<0.0001）,而N-cad、vimentin表达高于control-NL组（p<0.0001）。免疫组化结果显示:在control-NL组肾组织中,ING4在肾小管上皮细胞核中表达较为显著,UUO-L组中表达较对照组有明显降低。HIF-1α表达相反,在UUO-L组的肾小管上皮细胞中表达显著升高,主要在细胞核中表达,胞浆中少量表达,而control-NL组核表达不明显,在胞浆中少量表达。UUO-L组ING4的m RNA水平及蛋白表达量低于control-NL组（p<0.0001）,而HIF-1α的m RNA水平及蛋白表达量高于control-NL组（p<0.0001）。2、低氧培养HK2细胞,细胞的形态由单层鹅卵石样变成梭形的成纤维细胞样,细胞之间间距增加。低氧条件下细胞的活力较常氧条件下细胞活力降低。与常氧组相比,低氧组vimentin和N-cad的蛋白表达量增加（p<0.01）,E-cad的蛋白表达量下降（p<0.0001）,纤维化标志物Collagen I、Collagen IV显著增多（p<0.01）。与常氧组相比,低氧组HK2细胞中ING4的m RNA水平及蛋白水平下降（p<0.0001）。构建ING4过表达质粒p EGFP-N1-ING4,转染HK2细胞,与vector组比较,ING4过表达组m RNA水平和蛋白表达显著升高（**p<0.01,***p<0.001）,证实ING4过表达质粒构建成功。与转染空质粒的对照组相比,过表达ING4组HK2细胞中的Collagen I、Collagen IV的m RNA水平下降（*p<0.05,**p<0.01）,E-cad的蛋白水平升高（**p<0.01）,而vimentin和N-cad的表达量下降（**p<0.01,***p<0.001）。3、低氧培养HK2细胞,与常氧组相比,低氧组HIF-1α的m RNA和蛋白水平升高（**p<0.01）,且snail的m RNA和蛋白水平亦升高（*p<0.05,**p<0.01）。低氧条件下,与转染空质粒组相比,过表达ING4组中HIF-1α和snail的m RNA水平下降（*p<0.05,**p<0.01）,HIF-1α和snail的蛋白水平亦下降（**p<0.01）。转染ING4过表达质粒的HK2细胞在低氧条件下培养,与未经DMOG处理组相比,经DMOG处理组的Collagen I、Collagen IV的m RNA水平显著升高（***p<0.001）,E-cad的蛋白表达量减少（*p<0.05）,N-cad和snail的蛋白表达量明显升高（****p<0.0001）。结论:1、体内实验和体外实验证明,ING4参与肾间质纤维化过程,且与HIF-1α共同参与调节EMT。2、低氧诱导HK2细胞发生EMT后,ING4表达下降,HIF-1α和snail表达升高。3、过表达ING4可以抑制低氧诱导HK2细胞发生EMT,并抑制HIF-1α和Snail的表达。4、低氧条件下,加入HIF-1α激活剂DMOG使HIF-1α稳定表达后,ING4对EMT和Snail的抑制作用减弱。5、低氧条件下,ING4可能通过下调HIF-1α进而抑制Snail的表达来逆转HK2细胞发生EMT。