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高致病性禽流感（HPAI）是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一类禽类病毒性传染病。该病不但严重影响养禽业的发展和国际贸易,而且对人类健康也构成越来越大的威胁。常规灭活苗对控制禽流感的发生流行起到了非常重要的作用,但也存在难以克服的缺点,如存在散毒的潜在危险、不能有效激发细胞和黏膜免疫应答等,因此需要研究一种安全、高效的新型疫苗克服上述不足。减毒沙门菌可作为疫苗载体,通过自然黏膜感染途径运送DNA疫苗至宿主特定的免疫器官和细胞,表达外源抗原,激发机体产生保护性的细胞、体液和黏膜免疫应答。减毒沙门菌作为载体可用于运送禽流感DNA疫苗,为禽流感的防治带来新思路和新手段。沙门菌侵入细胞后并不能迅速进入胞液并释放内含的DNA疫苗,已经成为重组沙门菌疫苗载体研究的阻碍之一。本研究构建了一种镁离子调控的沙门菌裂解系统,该系统在胞内低镁离子浓度下会发生裂解,从而释放出所携带的DNA疫苗。在此基础上,构建出运送禽流感DNA疫苗的减毒鼠伤寒沙门菌,并对其免疫特性作初步探讨。1镁离子诱导裂解型沙门菌运送系统的构建与鉴定将本室构建的融合基因“S107”插入非抗性筛选DNA疫苗载体pPL的Mlu I位点,构建真核表达质粒pPL107。融合基因“S107”是由将Mg2+运输蛋白基因mgtC/B的启动子Pmgt置于λ噬菌体裂解基因之前构建成功,这样可以通过控制培养基中Mg2+的浓度使裂解基因在沙门菌中表达。将红色荧光蛋白DsRed基因分别连入pPL107和pPL中,构建出重组表达质粒pPL107DsRed和pPLDsRed。重组表达质粒pPL107DsRed和pPLDsRed分别转染COS-7细胞,24h后,在荧光显微镜下观察到强烈的红色荧光。上述重组表达质粒通过电转化转入SifA基因突变型鼠伤寒沙门菌X4550*,经筛选鉴定获得阳性转化子,分别命名为X4550*（pPL107DsRed）和X4550*（pPLDsRed）。将X4550*（pPL107DsRed）和X4550* （pPLDsRed）预培养的菌液分别洗涤,并重悬于N基础培养基,当培养基中Mg2+浓度很低时,融合基因“S107”发生表达,X4550*（pPL107DsRed）在2h内就会发生裂解,约80%的细菌死亡,并可在溶液中检测出释放的重组真核表达质粒pPL107DsRed,当在培养基中添加了足量的Mg2+时,融合基因“S107”的表达就会受到抑制。X4550*（pPL107DsRed）在LB培养基中过夜培养,其生长能力与X4550*（pPLDsRed）没有明显差异。体外真核表达质粒递送试验显示, X4550*（pPL107DsRed）可以将真核表达质粒运送给巨噬细胞系RAW264.7,并表达红色荧光蛋白,说明该系统可将自身携带的DNA疫苗传递给真核细胞。本研究获得了在体内自我诱导宿主菌有效裂解释放DNA疫苗的方法,这为进一步研究和利用该DNA疫苗输送系统奠定了基础。2镁离子诱导裂解型沙门菌运送H5亚型禽流感病毒DNA疫苗免疫原性的初步研究利用限制性内切酶BamH I和Nhe I切出pVAX1-HA上的HA基因,并连入相应酶切的pPL107和pPL载体中,BamH I和Nhe I酶切电泳鉴定正确,获得重组表达质粒pPL107HA和pPLHA。重组表达质粒转染COS-7细胞,间接免疫荧光试验表明,HA基因在COS-7细胞中获得表达。通过电穿孔转化法,将pPL107HA和pPLHA转入SifA基因突变型减毒鼠伤寒沙门菌X4550*中,抽提质粒后酶切鉴定正确,从而获得携带DNA疫苗的重组沙门菌,分别命名为X4550* （pPL107HA）和X4550* （pPLHA）。重组菌X4550* （pPL107HA）和X4550* （pPLHA）以每只1×107CFU的剂量静脉注射免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,两周后以同样的方法进行第二次免疫。二免后两周,各重组菌免疫组测得的针对禽流感病毒HA蛋白的特异性血清抗体都较低。用制备的H5亚型禽流感病毒作腹腔注射,2周后重组菌X4550* （pPL107HA）和X4550* （pPLHA）均可测得针对禽流感病毒HA蛋白的特异性血清抗体,并且重组菌X4550* （pPL107HA）免疫组与重组菌X4550*（pPLHA）免疫组能激发出较对照组更强的血清抗体水平。在刺激小鼠脾脏T淋巴细胞增殖方面,各免疫组在二免后两周均能刺激淋巴细胞增殖,但重组菌X4550* （pPL107HA）免疫组可以激发出较X4550* （pPLHA）免疫组以及对照组更强的针对HA蛋白的细胞免疫应答,差异显著（P<0.05）。上述结果说明,对于沙门菌介导的DNA疫苗来说,提高沙门菌释放DNA疫苗的能力有助于提高免疫效力,可以激发机体产生良好的细胞免疫应答。