第一部分温热应激通过促进细胞产生ROS增强结直肠癌细胞SW480对放疗的敏感性研究　　结直肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，多数患者就诊时已处于进展期，临床疗效较差[1,2]。放疗在结直肠癌的综合治疗中起着越来越重要的作用，术前放疗可提高结直肠癌患者的手术根治切除率，提高低位结肠癌患者的保肛率，减少术后局部复发的机会[3-5]。然而，由于肿瘤细胞对放疗敏感性的差异，放疗的效果也不同，部分接受手术及术前辅助放疗的患者仍然容易出现复发转移[6]。临床研究表明，热疗可增强放疗对结直肠癌细胞的杀伤作用，提高结直肠癌的放疗疗效，但其确切的机制尚不明确[7-9]。本课题通过细胞实验及动物模型实验研究温热应激促进肿瘤细胞产生活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)增强结直肠癌细胞对放疗的敏感性，探讨温热应激对放疗的增敏作用机制。　　目的：　　研究温热应激通过促进肿瘤细胞产生ROS增强结直肠癌细胞SW480对放疗的敏感性在杀伤肿瘤细胞中的作用。　　方法：　　1.细胞实验：将结直肠癌细胞SW480分为5组：①空白对照组；②热疗组（43℃）；③放疗组（6Gy）；④热疗+放疗组（43℃+6Gy）；⑤热疗+放疗+N-乙酰半胱氨酸组（43℃+6Gy+NAC）。各组细胞处理完成后，光学显微镜观察各组细胞的生长状态；流式双染检测各组细胞的凋亡情况、应用流式细胞仪（FCMs）检测各组细胞内ROS的含量及线粒体膜电位。　　2.动物实验：构建裸鼠左腹股沟皮下移植瘤模型，然后将成功构建左腹股沟皮下移植瘤的裸鼠随机分为5组，每组六只（n=6），分别为：①control组；②热疗组；③放疗组；④热疗+放疗组；⑤热疗+放疗+N-乙酰半胱氨酸（NAC）组。实验结束后采用颈椎脱臼法处死实验小鼠，切除肿瘤组织，测量肿瘤体积大小的改变情况，一部分肿瘤组织采用TUNEL观察肿瘤组织内细胞凋亡情况；另一部分制成细胞悬液，FCMs检测各组肿瘤细胞内ROS的含量及线粒体膜电位。　　结果：　　1.显微镜下观察不同处理对细胞的杀伤效果，结果表明：与对照组相比，放疗组、热疗组、热疗+放疗组、热疗+放疗+NAC组细胞均出现不同程度的生长速度缓滞，细胞形态倾向于梭形或变圆，并且出现漂浮的死亡细胞；直观的观察到不同处理对细胞的杀伤效果，其中放疗组出现漂浮死亡的细胞多于热疗组；热疗+放疗组细胞生长最慢，漂浮死亡的细胞数最多；热疗+放疗+NAC组出现漂浮死亡的细胞与热疗+放疗组相比有所减少。　　2.流式双染检测各组细胞的凋亡情况，结果显示：与对照组相比，放疗组、热疗组、热疗+放疗组、热疗+放疗+NAC组各种处理均能促进细胞出现不同程度的凋亡，差异有统计学意义（p<0.05）；放疗组细胞的凋亡率高于热疗组，差异有统计学意义（p<0.05）；热疗+放疗组细胞的凋亡率明显高于其他各组，差异有统计学意义（p<0.05）。热疗+放疗+NAC组细胞的凋亡率低于热疗+放疗组，两组间比较差异有统计学意义（p<0.05）。　　3.FCMs检测各组细胞内ROS水平，结果显示：与对照组相比，放疗组、热疗组、热疗+放疗组、热疗+放疗+NAC组细胞内ROS水平出现不同程度升高，差异有统计学意义（p<0.05）；放疗组细胞内ROS水平高于热疗组，两组间比较差异有统计学意义（p<0.05）；热疗+放疗组细胞内ROS水平明显高于其它组，差异有统计学意义（p<0.05）；热疗+放疗+NAC组ROS的水平与热疗+放疗组相比明显降低，两组间比较有统计学差异（p<0.05）。　　4.FCMs检测各组细胞线粒体膜电位的变化，结果显示：与对照组相比，放疗组、热疗组、热疗+放疗组、热疗+放疗+NAC组细胞线粒体膜电位出现不同程度下降，差异有统计学意义（p<0.05）；放疗组细胞线粒体膜电位下降水平高于热疗组，差异有统计学意义（p<0.05）；热疗+放疗组细胞内线粒体膜电位下降程度最明显，明显高于其它组，差异均有统计学意义（p<0.05）；热疗+放疗+NAC组细胞线粒体膜电位下降水平低于热疗+放疗组，两组间差异有统计学意义（p<0.05）。　　5.游标卡尺测量各组裸鼠移植瘤体积变化，结果显示：接种结直肠癌SW480细胞12天后裸鼠皮下移植瘤体积可达到500mm3，之后各组给予不同处理，每三天测量一次裸鼠移植瘤体积，与对照组相比，放疗组、热疗组、热疗+放疗组及热疗+放疗+NAC组裸鼠移植瘤体积增长出现不同程度减慢，差异有统计学意义（p<0.05）；放疗组裸鼠移植瘤体积小于热疗组，差异有统计学意义（p<0.05）；热疗+放疗组移植瘤体积小于其它各组，差异均有统计学意义（p<0.05）；热疗+放疗+NAC组移植瘤大于热疗+放疗组，两组间差异有统计学意义（p<0.05）。　　6.FCMs检测各组裸鼠移植瘤细胞内ROS水平，结果与细胞实验一致：放疗组、热疗组、热疗+放疗组、热疗+放疗+NAC组裸鼠移植瘤细胞内ROS水平均高于对照组，差异有统计学意义（p<0.05）；放疗组裸鼠移植瘤细胞内ROS水平高于热疗组，差异有统计学意义（p<0.05）；热疗+放疗组裸鼠移植瘤细胞内ROS水平明显高于其它组，差异有统计学意义（p<0.05）；热疗+放疗+NAC组裸鼠移植瘤细胞内ROS水平低于热疗+放疗组，两组间比较有统计学差异（p<0.05）。　　7.FCMs检测各组裸鼠移植瘤细胞线粒体膜电位的变化，结果与细胞实验一致：放疗组、热疗组、热疗+放疗组、热疗+放疗+NAC组裸鼠移植瘤细胞线粒体膜电位出现不同程度下降，差异有统计学意义（p<0.05）；放疗组裸鼠移植瘤细胞线粒体膜电位下降水平高于热疗组，差异有统计学意义（p<0.05）；热疗+放疗组裸鼠移植瘤细胞线粒体膜电位下降程度最明显，明显高于其它组，差异均有统计学意义（p<0.05）；热疗+放疗+NAC组裸鼠移植瘤细胞线粒体膜电位下降水平低于热疗+放疗组，两组间差异有统计学意义（p<0.05）。　　8.TUNEL检测各组裸鼠移植瘤组织细胞凋亡情况，结果表明：热疗组、放疗组、热疗+放疗组、热疗+放疗+NAC组裸鼠移植瘤细胞凋亡水平高于对照组，热疗+放疗组裸鼠移植瘤细胞的凋亡水平明显高于其它组；热疗+放疗+NAC组裸鼠移植瘤细胞的凋亡水平低于热疗+放疗组。　　结论：　　1.温热应激可增强放疗对结直肠癌细胞SW480的杀伤作用，促进结直肠癌细胞凋亡。　　2.温热应激通过诱导肿瘤细胞产生ROS增强结直肠癌细胞SW480对放疗的敏感性，增强放疗对结直肠癌细胞的杀伤作用。　　3.采用温热应激阻断剂处理可减少细胞内ROS的生成，降低结直肠癌细胞SW480对放疗的敏感性。