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双微体(Double minutes,DMs)是细胞中环状成对、可自主复制的额外染色体成分,是基因扩增的主要形式,经常含有扩增基因,参与细胞增殖,或为细胞生长提供选择优势。本实验室前期ArryCGH发现UACC-1598细胞中细胞外基质蛋白(Extracellular matrix protein1,ECM1)基因是高扩增的,且扩增倍数与双微体上已定位的MYCN基因是相似的。
目的:本课题想了解ECM1基因扩增和表达情况,获得ECM1基因在双微体上的定位情况,同时对ECM1基因启动子活性区域分析,获得该基因的表达调控信息,从而进一步了解双微体的功能。
方法:本研究首先运用Real Time PCR方法验证了双微体上ECM1基因在卵巢癌细胞中扩增和表达情况,运用FISH技术对ECM1基因的定位进行了分析。同时构建了MYCN正义表达载体,将其转入293T细胞后,应用RT-PCR、实时定量PCR、Western blot检测MYCN、ECM1不同时间点的表达水平。此外,为了研究MYCN和ECM1的调控关系,构建ECM1基因启动区域不同截短片段的双荧光素酶报告基因系统重组体,通过检测荧光素酶活性寻找ECM1与MYCN结合的最小启动子区域。
结果:通过Real Time PCR方法和FISH技术验证了ECM1基因在卵巢癌细胞UACC-1598中高扩增和高表达的并且定位于双微体上。过表达MYCN后,发现ECM1基因表达上调。报告基因分析发现ECM1基因与MYCN的结合位点位于ECM1基因转录起始位点上游-221-152bp。
结论:(1)ECM1基因定位于双微体上,双微体这种癌基因的载体形式可能通过自身的表达调控参与了肿瘤的发生。(2)MYCN能调控ECM1基因的表达,它们可能共同作用促进细胞出现致瘤性转化使得卵巢癌的发生,它们是卵巢癌基因治疗潜在的靶点。(3)MYCN通过结合ECM1基因启动子区域的E-box,促进ECM1基因的表达。