蓝氏贾第虫是一种重要的人兽共患寄生性原虫,寄生于人和多种哺乳动物的小肠,常引起以腹泻、腹痛和消化不良等为主的贾第虫病。贾第虫滋养体具有高度发达的细胞骨架系统(微管、微丝和骨架蛋白),在入侵宿主过程中能够释放一些分泌性蛋白,两者均与其致病机理密切相关。本文以人兽共患的蓝氏贾第虫A型为研究对象,分别扩增贾第素α-13和延伸因子EF-1α的编码基因并进行原核表达,利用Ni-NTA Resin层析柱对表达产物进行纯化,分别制备多克隆抗体对贾第素α-13及EF-1α进行滋养体的亚细胞定位,以便为探索贾第素α-13及EF-1α的生物学功能奠定基础。1.贾第素α-13的原核表达及亚细胞定位。根据GenBank中贾第素α-13基因序列设计引物,以贾第虫DNA基因组为模板,扩增贾第素α-13基因。构建重组表达质粒pET-28a(+)-g-α13并转化BL21(DE3)感受态细胞。采用IPTG诱导和复合自动诱导培养基(ZYM-5052)对目的蛋白进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定并经Ni-NTA Resin层析柱纯化,纯化产物与免疫佐剂乳化后免疫昆明鼠制备多克隆抗体。通过Western blot筛选特异性抗血清,采用间接免疫荧光法对贾第素α-13进行亚细胞定位。结果显示,贾第素α-13基因全长为1038 bp,编码345个氨基酸,融合蛋白Mr约为40 kDa,主要以可溶性形式存在。试验获得了大量高纯度的融合蛋白。制备的多克隆抗体具有良好的抗原结合力及特异性,间接免疫荧光显示贾第素α-13主要位于滋养体的鞭毛和细胞膜。2.延伸因子EF-1α的原核表达及亚细胞定位。根据GenBank中EF-1α基因序列设计引物,以贾第虫DNA为模板,扩增EF-1α基因。构建重组表达质粒pET-28a(+)-EF-1α并转化BL21(DE3)感受态细胞。采用IPTG对目的蛋白进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,并采用Ni-NTA Resin层析柱纯化。经生物信息学分析后合成EF-1α抗原肽,与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,采用Protein A Resin亲和层析纯化抗体,通过Western blot验证抗体结合力,最后采用间接免疫荧光法对EF-1α进行亚细胞定位。结果显示,EF-1α基因全长为1329 bp,编码442个氨基酸,融合蛋白Mr约为50 kDa,试验获得了较纯净的融合蛋白;抗体AFL1192具有良好的抗原结合力与特异性,间接免疫荧光显示EF-1α主要定位于滋养体两细胞核周围的胞浆中。