猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种传染性呼吸道疾病。该病在各年龄阶段猪均有发生。临床症状以病猪呼吸困难为特征,病理变化主要是肺部不同程度的充血、出血和纤维素性肺炎,该病的发病率和死亡率常在20%以上,在我国的发生呈现上升趋势,给我国养猪业造成了严重的经济损失。APP的致病因子较多,包括荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白及溶血毒素(Apx)等,其中溶血毒素是最重要的致病因子,同时研究证实溶血毒素也是重要的免疫原性因子。本试验对毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ进行提纯,并进行三种毒素对小鼠致病性及免疫保护性的研究,为研制有效的多组分亚单位疫苗提供理论依据,对有效预防和控制猪传染性胸膜肺炎,保护和促进养猪业的健康发展具有重要意义。本研究内容分两个部分:第一部分:猪胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素的提取与纯化。根据猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清10型只分泌ApxI、血清7型APP只分泌ApxⅡ和血清3型主要分泌ApxⅢ的特点,分别对血清10、7、3型APP进行培养,对毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ进行提取并对其纯化。将血清10、7、3型APP山东分离株分别接种于含0.02%NAD的LB液体培养基中,并对毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ最适分泌条件进行优化。在毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ最适分泌条件下培养血清10、7、3型APP,将培养液4℃5000 r/min离心20 min,取上清液,经硫酸铵盐析、透析、浓缩、葡聚糖凝胶分子筛层析,分别从血清10、7、3型APP培养上清液中分离纯化毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ。纯化的毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ经SDS-PAGE、Western blot进行分析。结果毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ最适分泌时间分别为12 h、12 h和24 h,最适硫酸铵饱和度均为60%。纯化的毒素SDS-PAGE结果显示,ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ大小分别为105 kD、103 kD、120 kD。在Western-blot中,三种毒素分别在相应的分子量大小处出现特异性条带,表明获得的三种毒素具有良好的反应原性。第二部分:溶血毒素对小鼠致病性与免疫保护性的研究。将纯化的三种毒素分别进行致病性与免疫原性研究。致病性试验中为验证毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ的毒性,将纯化的三种毒素进行半数致死量测定,同时将试验分为对照、ApxI、ApxⅡ和ApxⅢ四组,试验组以400μg/只的剂量腹腔注射小鼠,分别于1 d、7 d、14 d后眼眶放血致死,进行血常规及血液生化相关指标检测,同时对体重变化进行全程记录。结果毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ的半数致死量分别为80.9 mg/kg、108.6 mg/kg、128.8 mg/kg;毒素ApxI对小鼠的生长、血常规和血液生化指标影响最大,其次为ApxⅡ、ApxⅢ。免疫保护试验中,测定毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ的最佳免疫剂量分别为40μg、50μg、80μg。按最佳免疫剂量进行不同组合,制备4种亚单位疫苗(ApxⅠ+ApxⅡ、ApxⅡ+ApxⅢ、ApxⅠ+ApxⅢ、ApxⅠ+ApxⅡ+ApxⅢ),并分别于30日龄和40日龄免疫小鼠,60日龄时用血清1、3、5、7、10型APP攻毒。制备的4种亚单位疫苗免疫小鼠后,对血清1、3、5、7、10型APP攻击的平均保护率分别为87.5%、80%、84.1%、97.5%,表明含三种溶血毒素的亚单位疫苗的免疫保护作用明显优于其它含有两种溶血毒素的疫苗。研究表明毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ在猪传染性胸膜肺炎的免疫保护过程中具有一定作用,该研究为研制新型高效的猪传染性胸膜肺炎疫苗提供了理论基础。