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美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein,PAP)是一种存在于美洲商陆(Phytolacca Americana)叶子中的Ⅰ型核糖体失活蛋白,有多种生物学功能。与Ⅱ型核糖体失活蛋白不同,它具有良好的抗肿瘤和抗病毒活性,特别是它能抑制HIV-1的复制,可能有临床应用前景,因而受到了广泛关注。 本论文在实验室已有基础上成功将PAP基因克隆至表达载体pET-44a(+)并在大肠杆菌中表达,利用非放射性ELISA方法,证实了PAP对HIV-1整合酶有抑制作用,IC50为1.82μg/ml。此外,结构上PAP只具有一条活性A链,目前为止国内外对不含受体链B链的Ⅰ型核糖体失活蛋白包括PAP,在哺乳细胞内细胞内的转运途径研究很少,利用免疫电镜胶体金实验,我们发现PAP在HEP-G2细胞内转运到达了内质网和细胞核.PAP能够入核表明它很可能通过进入细胞核内发挥切割病毒基因组或抑制HIV-1整合酶,从而达到抑制病毒复制的目的。1.PAP基因的表达,纯化及活性鉴定利用本实验室构建的pET-44a(+)-PAP原核表达基因,将质粒pET-44a(+)-PAP用CaCl2法转化进入E.coli BL21(DE3)中,经1mM IPTG诱导表达得到PAP包涵体。包涵体经过尿素变性,低温透析复性后,用颜料亲和层析(Blue-sepharose)和弱阳离子交换层析(CM-sepharose)法纯化。纯化蛋白浓缩后用Brandford法测定蛋白浓度,12％SDS-PAGE检测蛋白纯度,密度扫描蛋白的纯度达到95%.以MTT法验证PAP对肝癌细胞HEP-G2和肿瘤细胞的细胞毒性并计算IC50,PAP对HeLa和HEP-G2细胞的IC50分别为22μg/ml和17μg/ml.将不同浓度的PAP与质粒pBluescript SK(+)超螺旋DNA反应,PAP能将超螺旋DNA切割成线性和开环DNA。结果表明:以包涵体形式表达的重组PAP经过变性与复性,纯化恢复了良好的生物学活性。2.PAP多克隆抗体制备健康新西兰雄兔2只,初次免疫每只兔子用1mg PAP与完全弗氏佐剂1:1混合乳化后皮下多点注射。以后每隔一周加强免疫一次,加强免疫每只兔子用0.5mg PAP与不完全弗氏佐剂1:1混合乳化,皮下多点注射。第3次加强免疫后一周颈动脉采血,分离血清。在初次免疫前于每只兔子的耳缘静脉各取2ml血液,分离血清于-20℃冻存,作为阴性对照。ELISA法测定抗体效价达到1:128000。Western Blot检测抗体特异性,未纯化和已纯化的PAP以及HEP-G2细胞破碎液在12%SDS-PAGE胶上电泳,湿转至硝酸纤维素膜,5%脱脂奶粉封闭后,一抗(兔抗PAP多克隆抗体1:5000稀释)孵育,过氧化物酶标记羊抗兔二抗孵育,ECL显影检测。未纯化和纯化的蛋白样品处均只有PAP被抗体识别出来,说明PAP抗血清有良好的特异性。此外,HEP-G2细胞破碎液的泳道未见条带,说明PAP抗血清对HEP-G2细胞的蛋白没有非特异的识别,为下一步进行免疫电镜试验打下基础。3.PAP对HIV-1整合酶的抑制实验HIV-1整合酶是在细胞核内将病毒cDNA整合进入人体基因组的关键酶。为检测PAP对整合酶是否具有抑制作用,我们采用一种非放射性ELISA方法,模拟体内整合过程。经检测发现PAP在体外对HIV-1整合酶有良好的抑制作用,IC550为1.82μg/ml。4.竞争抑制ELISA实验展示七肽TPSHSSR,HPERATL的两个M13噬菌体克隆是本实验室从随机线性七肽库中筛选到的与HIV-1整合酶有特异结合作用的噬菌体克隆。TPSHSSR,HPERATL对整合酶的整合活性有抑制作用,IC50分别为54.56±51.8μM和28.292±1.32μM。为检测PAP能否与上述七肽竞争抑制整合酶,我们设计了竞争ELISA实验。在96孔免疫吸附板中包被整合酶蛋白,加入不同浓度的PAP及一定量展示七肽的噬菌体溶液,使两者竞争结合整合酶。经洗涤后,用辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体检测与整合酶结合的M13噬菌体。发现PAP抑制七肽TPSHSSR与整合酶的结合成剂量依赖性,而对七肽HPERATL则几乎没有抑制作用。5.免疫电镜观察PAP在HEP-G2中的定位PAP在细胞内的定位对解释其发挥生物学活性机制尤其是其抗病毒活性是很有帮助的,处理组将PAP加入生长状态良好的HEP-G2细胞至终浓度375μg/ml,对照组用PBS替代PAP,继续培养3.5h。收集细胞,固定,冷冻超薄切片。用合适稀释度的PAP兔抗血清孵育后,用胶体金标记的羊抗兔IgG孵育,电子显微镜观察。电子图片显示实验组经PAP处理的HEP-G2细胞胞核,胞浆内质网处有明显的胶体金颗粒的聚积,而对照组中细胞胞核,胞浆内质网未见胶体金颗粒。这个结果直接证明了PAP被HEP-G2细胞内吞后,到达了细胞内质网和细胞核。