为了适应因地球自转而导致的光照、温度、湿度等环境因素周期性变化,在自然界几乎所有的生物都有近24小时的昼夜节律,即生物钟。生物钟在分子、生化、细胞、生理及行为等各种水平上调节生物体生命活动。生物钟的分子机制是一个转录-翻译-负反馈调节环路。在哺乳动物中,该环路由一对正向调节因子和一对负向调节因子组成:首先CLOCK和BMAL可以形成异二聚体,结合到PER和CRY启动子区域的E/E’-box从而激活它们的转录。随后,PER和CRY蛋白在细胞质结合形成异二聚体进入到细胞核内,通过作用于CLOCK:BMAL异二聚体,从而反馈抑制其本身的转录活性。在斑马鱼中存在三个clock基因,clock1a、clock1b和clock2。clock2又名npas2。Npas2是哺乳动物维持机体正常生物节律所必需的基因,在生物钟调控,并在细胞生长、分化凋亡、肿瘤生长抑制等诸多方面发挥重要作用。但是,至今关于clock2基因的在斑马鱼中具体功能和调控机制还不清楚。为了研究斑马鱼clock2基因的调控机制,我们克隆了clock2基因的启动子,细胞转染实验和荧光素酶报告实验发现Clock1a-Bmal1b异二聚体不能激活clock2启动子的活性;细胞转染实验发现Tefa可以激活clock2启动子的活性,ChIP实验发现Tefa可以直接结合到位于clock2基因启动子区域的D-box上;细胞转染实验也发现Rev-erbα可以抑制clock2启动子的活性。为了探究clock2基因在斑马鱼生物钟中的作用,本研究分析了先期利用CRISPR-Cas9技术构建的斑马鱼clock2突变体。行为实验表明,在正常光照条件下,从受精后第五天开始,斑马鱼clock2纯合突变体运动量和运动速度降低;在持续黑暗条件下,斑马鱼依然保持行为节律,但其周期缩短了0.6个小时,相位后移了3.5个小时;在持续光照条件下,clock2突变体周期延长1.4个小时,相位后移了0.5个小时。实时定量PCR显示,在纯合clock2突变的斑马鱼幼体中,在持续黑暗和持续光照条件下,生物钟基因per1a、per1b、per2、per3、cry1aa、cry1ab、cry1ba和cry1bb的表达都显著改变。在正常光照条件下,在clock2的突变体幼鱼中,clock1a、clock1b的表达量升高;在持续黑暗条件和光照条件下,在clock2的突变体中,clock1a、clock1b的表达量降低。这些结果表明Clock2对于保持斑马鱼生物钟的节律起到重要作用。斑马鱼clock2纯合突变体,相对于野生型其生长变慢,雌雄比降低。为了深入研究clock2的调节功能,我们通过转录组测序分析clock2突变体胚胎在ZT0(120hpf)基因表达图谱。与野生型相比,clock2突变体有277个基因上调,144个基因下调。其中tyr、prkacbb-2、ednaba与黑素原生成相关,gadd45a、anapc5、cadm1b与细胞周期/黄体酮调节卵母细胞成熟这一过程有关,说明clock2基因除了在生物钟系统中发挥重要作用之外,可能在斑马鱼的黑素原形成、生长发育和细胞周期调节上也有一定的作用。本研究阐述了斑马鱼clock2基因不但直接受到生物钟调控,也在斑马鱼生物钟调节中起到了重要作用,初步探究出了clock2敲除对斑马鱼核心生物钟基因表达、发育以及行为的影响;这些发现完善了斑马鱼生物钟环路以及clock2的功能研究,为后续的研究提供了基础。