原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的发病率在我国居恶性肿瘤发病率的第2位，每年约有11万人死于HCC。外科手术切除和肝移植是目前能够使肝癌获得根治的唯一措施，但是多数患者诊断时已届入中晚期，总体手术切除率不足30％。且即使是手术切除成功的患者，术后复发率仍然很高，5年复发率高达70-80％，预后极差。如何治疗术后复发、远处转移和诊断时已进入晚期的肝癌病例，是提高肝癌患者总体生存率的关键所在。　　 肝癌的免疫治疗近年来发展迅速，在基础和临床前期研究中取得了令人鼓舞的治疗成果。但和其它恶性肿瘤类似，肝癌存在着严重的肿瘤免疫微环境抑制，大大影响了肝癌免疫治疗的效果。肿瘤免疫微环境是肿瘤免疫效应阶段的执行场所，当免疫微环境较强时可以有效地抑制肿瘤生长，当处于耐受状态时则对肿瘤的生长具有促进作用。调节性T细胞(Regulatory T cell； Treg)的浸润是肿瘤免疫微环境抑制的重要机制之一。Treg是一类能够抑制机体免疫功能的负性调控细胞，在维持人体自身免疫稳定和调节免疫应答过程中起着重要作用。Treg在多种肿瘤患者的外周血和肿瘤组织呈现高表达，高表达的Treg很可能通过抑制CD4+、CD8+T淋巴细胞的肿瘤杀伤效能或引起效应性T淋巴细胞(Cytotoxic Tlymphocytes；CTL)对肿瘤抗原的耐受而不产生急性或记忆性CTL反应，最终逃避免疫攻击进而营造了机体免疫抑制微环境状态，从而介导了肿瘤的免疫逃逸。有关Treg同HCC的研究表明，Treg有可能成为肝癌免疫治疗的靶点之一。　　 HCC对化疗不敏感，且容易发生多药耐药现象，使得HCC单药或者多药联合化疗的总体有效率不足20％，当前尚无统一成熟和固定的化疗方案和治疗模型。但是，相比于其它治疗手段，化疗具有以下独特的治疗优势：1、可以杀伤包括肿瘤干细胞在内的增殖期细胞，范围涵盖了所有的肿瘤细胞，包括肿瘤原位病灶及发生远处转移的病灶；2、杀伤肿瘤细胞，减少机体的肿瘤负荷；3、杀伤造血细胞，改变血液中细胞的稳态分布，诱导骨髓细胞增殖，导致体内淋巴细胞亚群分布变化，特别是杀伤抑制性淋巴细胞亚群(如Treg)，降低机体免疫抑制。　　 传统的观点认为化疗对机体免疫功能具有显著的抑制作用，化疗和免疫治疗两者存在冲突或者拮抗作用。近年来研究表明事实情况可能并非如此。除了直接杀伤肿瘤细胞，减轻机体瘤荷的作用之外，化疗杀伤的肿瘤细胞可以作为肿瘤抗原在肿瘤原位被抗原提呈细胞(Antigen presenting cell； APC)提呈给T淋巴细胞，进而激活特异性抗肿瘤免疫。但是该种由化疗带来的免疫“增强”效应微弱，不足以完全抑制残余瘤灶的生长。此外，部分化疗药物可以通过增加肿瘤组织对CTL的渗透能力，或者通过杀伤肿瘤细胞，诱导特定肿瘤抗原暴露，进而激活CTL等模式增强特异性抗肿瘤免疫。简言之，部分化疗药物除去固有的直接杀瘤效应以外，还存在着免疫增强作用，如果予以合理运用，有可能和免疫治疗实现协同互补作用，即所谓的“免疫化疗”(immuno-chemotherapy orchemo-immunotherapy)。　　 综上所述，如果能够充分利用化疗的减瘤效应和“免疫增强”效应，并改善肝癌肿瘤组织免疫微环境抑制，在此基础之上进一步提高机体对肿瘤抗原的提呈能力，就有可能实现采用免疫化疗模式治疗肝癌的目的，为晚期肝癌的治疗提供新的治疗策略。　　 鉴于此，我们拟开展以下研究：(1)通过肝癌临床标本的检测进一步确定Treg与HCC患者临床病理特征及预后之间的关系；(2)以Treg为作用靶点，采用小剂量环磷酰胺(Cyclophosphamide；CTX)抑制Treg，改善荷瘤鼠机体免疫微环境；通过化疗药物阿霉素(Doxorubicin； DOX)杀伤肿瘤细胞，减小瘤荷，在肿瘤原位释放大量肿瘤抗原；进而通过瘤内转染腺病毒Ad.GM-CSF，促进抗原提呈细胞对肿瘤抗原的呈递作用，并诱导CTL在肿瘤组织浸润，最终实现免疫化疗的协同杀瘤作用。　　 第一章、原发性肝癌患者组织Treg表达及其临床意义　　 目的：观察原发性肝癌组织Treg表达与患者临床病理特征及预后之间的关系，探讨Treg在HCC发病过程中可能起到的作用。　　 方法：用免疫组织化学方法对76例原发性肝癌患者的临床标本进行CD4、CD8、Foxp3(Treg特异性标志物)指标检测。对患者的生存期进行随访，运用Cox回归模型对患者总体生存期和无瘤生存期的预后因素进行分析。以Treg的中位值为截断值将所有病例分为Treg高表达组和Treg低表达组，运用Kaplan-Meier生存分析比较两组患者预后差别，用Spearman相关分析方法对Treg的分布变化与肝癌患者各项临床、病理指标进行相关性分析。　　 结论：瘤内Treg浸润为肝癌患者预后不良的独立预后因素，并且与门静脉癌栓形成和肿瘤多发病灶具有相关性。　　 第二章、抑制Treg联合瘤内转染Ad.GM-CSF增强肝癌阿霉素化疗效果的实验研究　　 第一节 腺病毒Ad.GM-CSF的制备、鉴定和Hepal-6肝细胞癌动物模型建立　　 目的：制备和鉴定表达GM-CSF的腺病毒，并建立小鼠肝癌细胞系Hepal-6的Balb/c裸鼠和C57BL/6J小鼠皮下肝癌模型。　　 方法：扩增腺病毒Ad.GM-CSF并检测病毒滴度；对获得的病毒产物通过PCR、ELISA法对GM-CSF表达进行验证。培养小鼠肝癌细胞Hepal-6，以2×106/只的剂量在Balb/c裸鼠和同源的C57BL/6J小鼠上建立皮下肝癌模型。　　 结论：制备了腺病毒Ad.GM-CSF并建立了两种不同类型的小鼠皮下肝癌模型，为下一步的实验提供了基础。　　 第二节 抑制Treg联合瘤内转染Ad.GM-CSF增强肝癌阿霉素化疗效果的动物实验　　 目的：探讨应用小剂量CTX抑制Treg，联合瘤内转染Ad.GM-CSF增强肝癌阿霉素化疗效果的可行性。　　 方法：建立C57BL/6J小鼠皮下肝癌模型，待肿瘤长至100-150mm3体积大小时随机分为6组：1、对照组(PBS)；2、环磷酰胺组(CTX)；3、阿霉素组(DOX)；4、瘤内Ad.GM-CSF注射组(Ad.GM-CSF)；5、环磷酰胺+阿霉素组(CTX+DOX)；6、环磷酰胺+阿霉素+Ad.GM-CSF瘤内注射组(CTX+DOX+Ad.GM-CSF)。观察小鼠皮下肿瘤生长情况和小鼠的生存期。治疗后无瘤生存80天以上的小鼠皮下再次接种2×106个肿瘤细胞，观察肿瘤生长和小鼠生存情况。　　 结论：小剂量CTX可以增强肝癌阿霉素化疗的效果，瘤内转染Ad.GM-CSF可以进一步增强该治疗效果。　　 第三节 抑制Treg联合瘤内转染Ad.GM-CSF增强肝癌阿霉素化疗效果的机制探讨　　 目的：探讨采用小剂量CTX抑制Treg联合瘤内转染Ad.GM-CSF增强肝癌阿霉素化疗效果的具体作用机制。　　 方法：1、采用流式细胞仪检测应用小剂量CTX前后C57BL/6J小鼠脾脏CD4+、CD8+、CD4+CD25highTreg等淋巴细胞浸润情况变化；2、建立Hepal-6肝细胞癌的Balb/c裸鼠模型，观察小剂量CTX和阿霉素联合应用在免疫缺陷的裸鼠体内的治疗作用；3、HE染色和免疫组织化学染色检测肿瘤组织细胞坏死，淋巴细胞浸润情况；4、通过乳酸脱氢酶释放实验(LDH实验)检测不同治疗措施对C57BL/6J小鼠脾脏CTL杀瘤活性的影响。　　 结论：小剂量CTX联合瘤内转染Ad.GM-CSF增强肝癌阿霉素化疗效果的机制可能包括：　　 1、小剂量CTX可以抑制小鼠脾脏Treg浸润，改善机体免疫微环境抑制；　　 2、小剂量CTX增强DOX治疗效果具有免疫依赖性，小剂量CTX对Treg的抑制作用可能为其主要机制；　　 3、瘤内应用Ad.GM-CSF可以增加肿瘤组织中CD4+、CD8+T淋巴细胞的浸润，提高脾脏CTL的杀伤活性，进而提高抗肿瘤细胞免疫。　　 综上所述，我们得出以下结论：　　 1、瘤内Treg浸润为肝癌患者术后无瘤生存期和总体生存期的独立预后因素，并且与肝癌患者门静脉癌栓(PVTT)的形成、肝内肿瘤病灶多发具有相关性。　　 2、小剂量环磷酰胺可以抑制小鼠脾脏Treg浸润，逆转机体的免疫抑制微环境；在抑制Treg的基础之上联合瘤内转染Ad.GM-CSF可以增强小鼠肝癌阿霉素化疗的效果。