背景和目的：人乳头瘤病毒(human papillomavirus HPV)感染和宫颈癌的密切关系已是现今不争的事实，即HPV感染，特别是高危型HPV感染，是引起宫颈癌及其癌前病变的主要病因。HPV感染强烈地预示着鳞状上皮内病变(SIL)的存在，对来自世界范围的宫颈癌组织标本的检测发现，99.7％的标本中均可检测到HPV-DNA。HPV感染的检测和分型是处理宫颈病变的重要依据，是宫颈癌筛查不可缺少的内容。然而，目前临床上应用的HPV检测方法存在假阳性率高、检测效率低、操作繁琐、成本高昂等问题，极大地限制了其推广应用。因此，开发一种更为快速、敏感、高效、准确的HPV检测和分型方法是目前亟待解决的一个问题。基因芯片技术是20世纪90年代发展起来的一门融合了分子生物学、材料科学、微电子学、物理学、化学、信息科学、计算机科学等多个学科的高新技术，是当今世界最前沿的研究热点。由于基因芯片技术可以对大量的生物样品进行平行、快速、敏感、高效的基因分析，因而在DNA序列测定、基因表达分析、基因组研究、基因诊断、药物研究与开发等领域得到了广泛应用。近年来，随着基因芯片技术的日渐成熟，其在病原微生物的基因诊断中也得到了广泛应用，并对病原微生物的基因诊断起着革命性的影响。本实验将基因芯片技术应用于HPV的检测与分型，建立了一种新的HPV检测与分型方法，探讨了4种常见HPV(6，11，16，18)检测及分型基因芯片的制作方法，优化确定了该芯片的最佳检测条件。郑州大学硕士研究生论文(2004)人乳头瘤病毒检测及分型基因芯片制备的初步研究 材料和方法:收集尖锐湿疵(50例)和宫颈癌(22例)石蜡包埋组织标本，用酚一氯仿抽提法从中提取DNA，用HPV-PCR检测试剂盒对其进行HPV检测，对结果阳性者进行纯化、重组克隆，经DNA序列测定，检索GenBank，保留HPV6，n，16，18阳性克隆为标准品。根据llPV Ll区基因序列特点，设计5条实验组探针(HPV通用探针、HPV6，n，16，18型特异性探针各一条)和3条对照组探针(与HPV没有同源性的一段植物基因为阴性对照，一段乙肝基因片段为阳性对照，不含任何基因片段的空白点样液为空白对照)，用GMS 417航ayer点样仪将其点样至经特殊处理过的玻片上，制成HPV检测及分型基因芯片。采用PCR引物直接标记法和掺入法对HPv标准品进行扩增和荧光标记，将标记好的标准品与芯片在梯度温度下(43℃，45℃，47℃，49℃，51℃)杂交1小时，用GMs 418 Array Sc~er扫描仪对杂交后的芯片进行扫描检测分析，用sca‘Array软件对各信号点进行信号强度采集。采用sPss10.o软件对不同标记方法、不同杂交温度下信号强度的差异性进行统计分析，两组间比较采用t检验，以a二O刀5为检验标准，确定该芯片的最佳杂交温度和样品的最佳标记方法。 结果: 1.对石蜡包埋组织标本中HPV一PCR扩增阳性产物，进行重组克隆，经测序验证，构建了HPV6，11，16，18的标准品(质粒)。 2.对于本研穷制作的芯片，PCR引物直接标记法的标记效率明显高于掺入法，两者的信号强度差异具有显著性(尸<0.01)。 3.各HPV标准品与本研究制作的芯片杂交，杂交温度为43℃和45℃时存在交叉错配信号;杂交温度为51℃时，无杂交信号;杂交温度为47℃和49℃时既无交叉错配信号，且各标准品与相应探针均有杂交信号;47℃下的杂交信号强度 气、明显强于49℃时，两煮的杂交信号强度差异具有显著性(P<O.01)。 4.采用PcR引物直接标记法对样品进行标记，杂交温度为47℃时，各HPv标准品与芯片的杂交图谱为标准图谱，即监控系统信号正常(即阳性对照有杂交信号而阴性对照和空白对照无杂交信号)且各HPV标准品与芯片杂交时，在其相应探针位点和通用探针位点出现阳性信号，各型别之间无交叉错配信号。郑州大学硕士研究生论文(2004)人乳头瘤病毒检测及分型基因芯片制备的初步研究结论:1.本研究发现，PCR引物直接标记法为理想的样品标记方法;最佳杂交检测温度为47℃。2.本研究制作的HPV检测及分型基因芯片是一种敏感、高效、快速、准确的HPV检测及分型方法，可以成功地用于壬开V的检测及分型。3.基因芯片技术用于HPV的分型诊断，具有巨大的优越性，可望推广应用于临床。4.HPV检测及分型基因芯片能够筛检出CIN及宫颈癌的高危人群，对CIN及宫颈癌的早期发现具有非常重要的价值。