论文部分内容阅读
脊椎动物MHC基因在免疫应答过程中发挥重要作用,是脊椎动物基因组中多态性最高的区域。MHC基因多态性赋予动物更为广泛的抗原识别与结合能力,被认为是研究脊椎动物适应性进化过程的最佳候选基因。MHC基因多态性受种群历史、统计学参数、瓶颈效应、环境病原体种类与丰度、行为及生态等多种因素影响。病原体介导的平衡选择被认为是维持MHC基因多态性的主要机制。麂属动物的黑麂(Muntiacus crinifrons)和黄麂(Muntiacus reevesi)在染色体组成、核型特征、进化历史、地理分布以及种群数量等方面均存在显著差异。本文以皖南同域分布的黑麂和黄麂为研究对象,通过比较这两种动物MHC-DQ基因的组成及其多态性,探讨麂属动物DQ基因多态性的一般特征及其维持机制。研究结果为揭示鹿科动物DQ基因进化机制提供来自麂属动物的证据,同时为我国特有的濒危野生动物——黑麂保护策略的制定提供来自功能基因的依据奠定基础。 本研究分为两个部分,首先,通过近缘种牛科动物DQB基因特异性引物对目标物种进行群体扩增,初步获得DQB基因多态性概括。在此基础上,利用磁珠杂交富集法从血液cDNA中分离目标物种的全长DQ基因表达序列,通过分析序列特征结合同源序列比较确定每个物种表达的DQ基因座位数目,并探讨其系统发育地位。主要结果如下: 1.利用牛科动物两对互补DQB基因座位引物BoDQB-FP-E2A/BoDQB-RP-E2C和AG7/AG8,从31个黒麂样品中共检测到35个等位基因Mucr-DQB*01~Mucr-DQB*35(图6A)每个样品所包含的等位基因数为2~5个;从37个黄麂样品中共检测到34个等位基因Mure-DQB*01~Mure-DQB*34(图6B)。所有序列均不包含插入或缺失突变,也没有检测到终止密码子,因此推测,本研究利用跨物种引物扩增出来的DQB基因序列均来自表达的功能基因。每个样品所包含的等位基因数为2~5个,提示该引物至少扩出黑麂座位和黄麂各3个DQB座位。 2.黑麂35个DQB exon2等位基因核苷酸突变位点的百分比为29.9％(73/244),所对应的氨基酸突变位点百分比为46.9%(38/81),其中,PBR区氨基酸突变位点的百分比为76.2%(16/21);黄麂34个等位基因核苷酸突变位点的百分比为22.1%(54/244),所对应的氨基酸突变位点百分比为35.8%(29/81),其中,PBR区氨基酸突变位点的百分比为66.7%(14/21)。两物种PBR区的非同义替换率(dN)均显著大于同义替换率(dS)(P<0.01),表明这两种动物的DQB基因exon2序列均经历了明显的正选择作用。利用CODEML程序中的密码子进化模型进一步检测出9个受正选择作用的氨基酸位点(9F,14L,26L,37H,57Q,61F,67I,71T和86E) 3.利用邻接法中的Kimura双参数模型构建了黑麂和黄麂DQB基因外显子2等位基因序列间的系统发生关系。黑麂和黄麂DQB外显子2等位基因构成4个不同的谱系,提示这两种动物可能拥有3-4个DQB座位。黑麂的Mucr-DQB*28~Mucr-DQB*35构成一个独立的谱系,其余3个谱系中黑麂和黄麂等位基因呈镶嵌式排列,而且,两物种有8个序列完全一致的等位基因,暗示跨物种进化是维持这两个物种DQB基因多态性的另一个重要机制。 4.利用磁珠富集杂交法分别从黑麂和黄麂血液cDNA中分离出3条不同的DQA基因全长cDNA序列,同源序列比较结合系统发生分析结果表明,这两种动物分别拥有至少两个表达的DQA基因座位,且至少有一个座位具有多态性。但系统发生关系分析显示这两种动物DQA基因座位具有不同的谱系来源,黑麂的两个DQA座位属于牛DQA2/DQA3谱系,而黄麂的两个DQA座位则属于牛DQA1基因谱系。这种谱系关系暗示牛科和鹿科动物共同祖先中就已经存在DQA单倍型多样性,而且这种多样性在后续的物种分化中被遗传下去。 5.利用磁珠富集杂交法从黑麂血液cDNA中分离出6条DQB基因,代表3个不同的DQB座位;从黄麂血液cDNA中共分离到4条DQB基因序列,代表两个不同的DQB座位。同源序列比较结合系统发生分析结果表明,黑麂至少拥有3个DQB基因座位,黄麂至少拥有2个DQB座位,而且,这些座位都具有多态性。基于全长cDNA序列的系统发生分析揭示,以牛DQB基因谱系为参照,反刍类DQB基因分属牛DQB1/DQB2和DQB5谱系。黄麂DQB1、麋鹿DQB2以及黑麂DQB1和DQB2均位于牛DQB1/DQB2谱系中;黄麂DQB2、麋鹿DQB1以及黑麂DQB3则归属牛DQB5谱系。这种谱系关系暗示牛科和鹿科动物拥有共同的祖先DQB基因,该祖先基因在牛科与鹿科动物分化之前通过重复突变产生两个不同的DQB谱系,即DQB1/DQB2和DQB5。牛、羊以及黑麂的DQB2基因是继该复制事件发生之后, DQB1通过再次重复突变产生的。