【摘 要】
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伪狂犬病毒为有囊膜的双链DNA病毒,属于疱疹病毒的成员。可以感染多种动物,其中猪为其贮存宿主,疫苗接种是防控该病的主要手段,且取得了良好的防控效果,但2011年以来国内伪狂犬病疫情再度大面积爆发,新的流行毒株发生了一定程度的变异,导致现有疫苗不能对新毒株的感染提供完全保护,因此有必要研制针对新流行毒株的疫苗。本研究拟采用基因缺失株rPRV-AH-gI-/gE-和rPRV-AH-gI-/gE-/g
【基金项目】
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广东省科技计划项目（2016A020210046、2016B090921009）；
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伪狂犬病毒为有囊膜的双链DNA病毒,属于疱疹病毒的成员。可以感染多种动物,其中猪为其贮存宿主,疫苗接种是防控该病的主要手段,且取得了良好的防控效果,但2011年以来国内伪狂犬病疫情再度大面积爆发,新的流行毒株发生了一定程度的变异,导致现有疫苗不能对新毒株的感染提供完全保护,因此有必要研制针对新流行毒株的疫苗。本研究拟采用基因缺失株rPRV-AH-gI-/gE-和rPRV-AH-gI-/gE-/g C+为疫苗毒株,MONTANIDE Gel 01（水佐剂）、MONTANIDE ISA 201 VG（油佐剂）为佐剂,分别制备两种缺失毒株的水佐剂灭活疫苗和油佐剂灭活疫苗,并以某商品化伪狂犬病灭活疫苗为对照,以评价其对小鼠和猪的免疫效果。主要研究内容如下:1.PRV-AH、rPRV-AH-gI-/gE-、rPRV-AH-gI-/gE-/g C+三种病毒的生物学特性分析将经鉴定的三种病毒分别接种BHK-21细胞,于感染后不同时间分别取样测定其TCID50,绘制3种病毒的一步生长曲线,结果表明重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-、rPRV-AH-gI-/gE-/g C+与亲本株PRV-AH具有相似的生长特性,3种病毒的最高滴度分别为:10-8.44/m L、10-8.76/m L、10-8.69/m L。将重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-、rPRV-AH-gI-/gE-/g C+分别在BHK-21细胞上连续传20代,分别提取第4、8、12、16、20代的基因组DNA,以其为模板,进行PCR鉴定,结果显示两种重组病毒均未出现基因丢失,表明两种重组病毒遗传稳定性良好。2.rPRV-AH-gI-/gE-与rPRV-AH-gI-/gE-/g C+灭活疫苗对小鼠的免疫效力评价以rPRV-AH-gI-/gE-和rPRV-AH-gI-/gE-/g C+为疫苗毒株,MONTANIDE Gel 01、MONTANIDE ISA 201 VG为佐剂,分别制备出病毒含量为105 TCID50/100μL和106TCID50/100μL的水佐剂灭活疫苗和油佐剂灭活疫苗。取每种疫苗100μL分别免疫小鼠,首免后4周加强免疫一次,同时以106 TCID50/100μL剂量的某商品化伪狂犬病灭活疫苗免疫组为阳性对照,以100μL DMEM为阴性对照;免疫后间隔一定时间分别采血,测定血清中和抗体;二次免疫后4周用100 LD50 PRV-AH毒株进行小鼠攻毒,对攻毒后死亡及处死的小鼠进行解剖,采集脑、肝、脾、肺制作病理切片,进行组织学病变观察。结果表明106 TCID50免疫组中和抗体水平、免疫保护率均优于105 TCID50免疫组,水佐剂疫苗组中和抗体水平及免疫保护率均优于油佐剂疫苗组。其中106TCID50 rPRV-AH-gI-/gE-/g C+、rPRV-AH-gI-/gE-水佐剂灭活疫苗免疫保护率均为100%,而某商品化伪狂犬病毒灭活疫苗组免疫保护率为87.5%;与商品化灭活疫苗组相比,106 TCID50 rPRV-AH-gI-/gE-/g C+免疫组脑、肝、肺组织病变更轻微,且水佐剂灭活疫苗组优于油佐剂灭活疫苗组。3.rPRV-AH-gI-/gE-和rPRV-AH-gI-/gE-/g C+灭活疫苗对猪的免疫效力评价用107 TCID50 rPRV-AH-gI-/gE-/g C+、rPRV-AH-gI-/gE-株水佐剂灭活疫苗和油佐剂灭活疫苗分别免疫实验猪2次,间隔4周,同时以107 TCID50某商品化伪狂犬灭活疫苗做阳性对照组,以1 m L DMEM为阴性对照;免疫后间隔一定时间分别采血,测定猪只血清中和抗体水平;二免后6周以106 TCID50PRV-AH对免疫猪进行鼻腔攻毒,于不同时间点采集鼻拭子,测定猪群的排毒情况。结果表明,rPRV-AH-gI-/gE-/g C+水佐剂灭活苗诱导猪产生的中和抗体水平高于商品化疫苗和rPRV-AH-gI-/gE-灭活疫苗,与商品化疫苗组及未免疫攻毒对照组相比,rPRV-AH-gI-/gE-/g C+、rPRV-AH-gI-/gE-水佐剂灭活疫苗均可以大大减轻感染猪的临床症状,但所有疫苗均不能有效阻止猪体野毒感染的排毒。综上所述,本研究制备了rPRV-AH-gI-/gE-/g C+、rPRV-AH-gI-/gE-水佐剂灭活疫苗和油佐剂灭活疫苗,并评价了疫苗对小鼠及猪的免疫效果,结果表明两种毒株的水佐剂灭活疫苗免疫效果均优于油佐剂灭活疫苗,且rPRV-AH-gI-/gE-/g C+水佐剂灭活疫苗免疫效果优于rPRV-AH-gI-/gE-水佐剂灭活疫苗及商品化灭活疫苗,有望作为一种良好的疫苗候选株用于PRV新流行株的防控。
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