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目的：肢体缺血性疾病是当前血管外科研究领域的难点，早期药物治疗效果较好；当病情进展，仍有血液流出道的情况下，可以采用手术重建肢体远端循环；而在疾病的后期，如出现肢体严重缺血或坏疽等，则需截肢。近年来干细胞移植治疗下肢缺血性疾病取得了一定的进展。采用细胞生长因子动员骨髓或外周血内的干细胞，采集鉴定后，用注射的方式将干细胞种植到缺血组织内，干细胞在局部促血管新生，改善缺血组织的血液循环。干细胞移植治疗肢体缺血性疾病目前存在干细胞量少、不易在组织中定植和形成新生血管等问题，此外三维重建的新生血管如何放置到需要的部位也是一个难题。而用液态组织工程技术负载供体细胞移植在国际国内研究少，本研究采用这种方式，提高细胞移植的成活率和对肢体缺血疾病的治疗效果。
方法： 1．大鼠骨髓单个核细胞的分离：选用8周龄的雄性大鼠，全麻后处死，无菌分离四肢长骨，用PBS冲洗髓腔，收集骨髓冲洗液。加红细胞裂解液(Tris-NH4)吹打成细胞悬液，将悬液移到另一试管，细胞悬液离心5分钟(800转/分钟)，获得骨髓单个核细胞，进行细胞计数及台盼蓝染色。2．组织工程支架的制作：Ⅰ型鼠尾胶原，细胞基底膜基质(Matrigel)，10×DMEM，0.1 mol/L NaOH混合，4℃下加入5×106个大鼠骨髓单个核细胞，(1)移到24孔培养板中，置于CO2孵箱中培养。(2)供移植使用。3．大鼠下肢缺血模型的制作：1％戊巴比妥钠按每公斤体重45mg的剂量进行雌性大鼠腹腔注射，全麻后将大鼠仰卧位固定在操作台上，切开左下肢皮肤及浅筋膜，暴露股动脉全长，结扎股动脉及其分支，检查切口无活动性出血，关闭切口。术后将大鼠单独饲养，每12小时检查一次切口，保持笼内卫生。4．手术2周后，随机分为4组，每组12只。A组为支架负载细胞组，将分离的雄性SD大鼠骨髓单个核细胞5×106个和ECM组织工程支架300μl联合注射移植到大鼠下肢内收肌群；B组为单纯细胞移植组，在大鼠下肢内收肌群移植雄性SD大鼠骨髓单个核细胞5×106个；C组为支架移植组，在大鼠下肢内收肌群移植ECM组织工程支架300μl；D组在下肢内收肌群注射生理盐水300μl，各组健侧下肢为自身对照。检查方法：1、细胞移植后两周，将大鼠置于木板搭建的平直单向通道中，在大鼠的尾侧给予10V的电刺激，让大鼠在通道中前进，记录大鼠的跛行距离；2．大鼠下肢动脉造影：细胞移植后2周，大鼠1％戊巴比妥腹腔注射全麻，行腹主动脉插管，结扎近心端腹主动脉，远心端灌注45％泛影葡胺1ml后，X光摄片；3．组织学检查：造影后处死大鼠，取左侧大腿相同部位肌肉行HE和免疫组化染色，一抗为兔抗大鼠Ⅷ因子相关抗原(武汉博士德)，二抗为山羊抗兔IgG抗体(北京中杉金桥)；4．下肢缺血模型大鼠为雌性，骨髓单个核细胞采集自雄鼠，含有Y染色体，SRY是雄性动物染色体上的性别决定区，雌性动物不具备，通过PCR检测SRY基因可了解来源于雄性大鼠的骨髓单个核细胞在雌性动物体内的存活情况，用紫外线分光光度计测定电泳条带的光密度值；5．数据以mean±s表示，3组间数据比较用单因素方差分析，LSD法行组间比较，采用SPSS 10.0统计软件分析，P<0.05为差异有统计学意义。
结果：1．从每只供体鼠的四肢长骨骨干中，能够获得(1.2±0.25)×107骨髓单个核细胞，台盼蓝染色>95％细胞拒染；2.液态ECM基质在4℃冰浴盒中配置，在37℃孵箱中，40分钟凝固为琼脂样固体物质；3.组织工程支架负载骨髓单个核细胞置于24孔板中培养8天，在倒置相差显微镜下观察见细胞已生长成日光放射状集落，部分细胞形成轴索样结构，在普通培养基中，细胞贴壁生长，呈铺路石样，未见轴索样结构形成；4.结扎大鼠股动脉后一周，手术侧下肢出现明显的缺血症状，表现为足趾坏死、趾甲脱落。大鼠因为疼痛不能活动患肢，行走时呈现拖拽步态，下肢动脉造影也证实该段动脉及分支被阻断；5.细胞移植后2周，支架负载细胞组(A组)的跛行距离为32±7.5cm；单纯细胞移植组(B组)跛行距离为28±6.5cm；支架移植组(C组)为13.5±4.5cm，阴性对照组(D)为13.2±4.3cm，A组大鼠跛行距离最长(P<0.05)：6.细胞移植后2周，模型动物全麻后通过腹主动脉插管进行下肢动脉造影检查，在X光片上覆盖一张透明网格纸，计数髂内、外动脉其主干及分支所占的小格数，A组为21.2±2.9/cm2，B组为18.7±2.8/cm2，C组为13.6±2.5/cm2，D组为12.5±1.75/cm2，其中A组的新生血管密度最高(P<0.05)；7.支架负载骨髓单个核细胞移植组(A组)和骨髓单个核细胞移植组(B组)都有SRY基因的存在，其OD值分别为230和180；而支架移植组(C组)和阴性对照组(D组)没有SRY基因的表达，A组Y染色体SRY的DNA含量最高(P<0.05)；8.在10×40倍视野下，A组小血管计数为18.5±5.3/HP，B组为15.3±4.2/HP，C组为5.8±2.2/HP，D组为6.5±2.3/HP，其中A组小血管密度最高(P<0.05)。
结论：本实验证实组织工程支架和骨髓单个核细胞联合移植组与单纯细胞移植组相比，新生血管数量、跛行距离、供体细胞的SRY基因表达均有显著提高，表明组织工程支架负载骨髓单个核细胞构建新生血管较单纯干细胞移植方法更能提高细胞的存活率和改善血管新生效果，因此组织工程支架负载骨髓单个核细胞移植有可能成为治疗肢体缺血性疾病的新途径。