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目的：近年来糖尿病的发生率逐年递增，由此导致的肾脏损害也逐年增加。糖尿病肾脏损害的机制目前尚不是很清楚，阐明糖尿病导致肾脏损害的发生机理对于探索其防治措施具有重要的临床意义。近年研究显示，由营养物过剩所诱导的代谢性炎症(metabolic inflammation)在代谢性疾病肾脏损害中可能起重要作用。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是机体固有免疫系统的受体之一，外界微生物可与TLRs结合并激活固有免疫、炎症反应，并进一步启动获得性免疫反应。近年发现一些内源性配体也可与TLRs结合，激活炎症反应。但目前对于TLRs系统与糖尿病肾损伤发生之间的关系研究较少，仅限于TLR2和TLR4，对于整个TLRs系统在糖尿病肾脏损害中的作用目前国际上并未进行系统地研究。Kruppel样转录因子14(Kruppel-like factors14，KLF14)是调控能量代谢的转录因子，全基因组关联分析表明该基因可能与Ⅱ型糖尿病有关，但是对其在糖尿病肾损伤中的作用还不清楚。近年来，虽然已经用大鼠等啮齿类动物建立了糖尿病模型，试图研究糖尿病及其肾损害的发生机制，但是由于啮齿类动物与人类存在较大差异，其研究结果并不能很好地模拟人类疾病的发生过程。与其他动物相比，人和小型猪在生理、病理、解剖、代谢作用等方面非常相似，并且与其他大型动物如灵长类动物相比，小型猪在伦理学和经济学方面具有更大优势，近年来小型猪作为一种大动物已经被用来建立多种人类疾病模型。小型猪肾脏功能及解剖结构和人相似，大小和形状也和人相似。另外，小型猪和人类一样是杂食动物，因此，用小型猪作为大动物模型研究人类营养代谢疾病具有极大的优势。本研究中，我们首先在高糖高脂饮食诱导的糖尿病小型猪模型中，系统地研究了固有免疫TLRs系统及其诱导的代谢性炎症反应在糖尿病肾脏损害中的作用，然后构建了转基因表达载体pCAG-KLF14拟建立糖尿病小型猪模型，以明确TLRs系统和KLF14在糖尿病肾脏损害中的作用机制。
方法：小型猪共24头，随机分为两组:(1)正常对照组(CON)6只:喂养基础饲料。(2)糖尿病组(DM)18只:喂养高糖高脂饲料（由51％基础饲料、2％的胆固醇、29％蔗糖、10％猪油组成）。饲喂周期为24个月。喂养过程中每2个月取血一次，测定生化指标（血糖、胰岛素、胰高血糖素、肌酐、尿素氮、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白）;PAS观察肾脏病理变化;用免疫组化和免疫荧光观察巨噬细胞标记物CD68; Western Blot检测内源性配体HSP70和HMGB1;用Western Blot检测MyD88依赖性通路TLRs(TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11)及其下游信号通路衔接分子MyD88和蛋白激酶Phospho-IRAK-1;用免疫组化观察TLR2、TLR4; Western Blot检测MyD88非依赖性通路分子TLR3、TLR4及其下游信号通路蛋白激酶Phospho-IRF-3;用Western Blot检测NF-κB信号通路分子(Phospho-IKKβ、Phospho-Iκ Bα、NF-κB p65和Phospho-NF-κB p65);用qRT-PCR检测肾组织中炎症因子IL-6、MIP-2、MCP-1、CCL5、VCAM-1 mRNA表达水平。对于pCAG-KLF14转基因表达载体的构建，通过提取小型猪肾脏总RNA、逆转录、RT-PCR获得目的基因、构建pEASY T1-KLF14克隆载体、测序、酶切回收、构建pCAG-KLF14真核表达载体。
结果：血生化检测表明在糖尿病模型组，血糖与胰岛素显著升高(P＜0.05)，而胰高血糖素未见统计学差异(P＞0.05);胆固醇、低密度脂蛋白水平显著升高(P＜0.05)，甘油三酯、高密度脂蛋白无明显变化(P＞0.05)。肾脏PAS显示，糖尿病组肾小球明显肥大、肾小管直径变大。免疫组化和免疫荧光显示，糖尿病组肾脏组织中巨噬细胞标记物CD68表达增加。糖尿病组肾脏组织中内源性配体HSP70表达增加。糖尿病组肾脏组织中参与MyD88依赖性通路的TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR11及其下游信号通路衔接分子MyD88、蛋白激酶Phospho-IRAK-1表达均增加，TLR1、TLR6、TLR9、TLR10没有显著变化;参与MyD88非依赖性通路的TLR3、TLR4及其下游信号通路蛋白激酶Phospho-IRF-3表达均增加。糖尿病组肾脏组织中NF-κB信号通路分子（Phospho-IKKβ、Phospho-Iκ Bα、NF-κB p65和Phospho-NF-κB p65）表达均增加。糖尿病组肾脏组织中炎症因子IL-6、MIP-2、MCP-1、CCL5、VCAM-1 mRNA表达水平显著升高。另外，我们成功构建了pCAG-KLF14转基因表达载体，拟用该重组表达载体通过核移植技术制备糖尿病转基因小型猪模型。
结论：结果表明，在糖尿病小型猪模型肾脏中，内源性配体HSP70、固有免疫系统TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR11以及TLR3、TLR4的表达明显上调，分别通过激活MyD88依赖性和MyD88非依赖性信号通路激活NF-κB信号通路，促进肾脏组织代谢性炎症反应。