Disabled-2(Dab2)是一种细胞内吞衔接蛋白，它氨基端含有重要的磷酸酪氨酸作用结构域(N-terminal phosphotyrosine binding，PTB/PID)，羧基端含有丰富的脯氨酸(PRD)，均具有分子调节作用。DNA甲基化作是一种重要的表观遗传机制，能够在不改变DNA分子一级结构的情况下调节基因组的功能，成为近年来的研究热点。有报道显示，某些肿瘤中Dab2表达下调与基因的启动子甲基化程密切相关。但目前Dab2基因启动子在肺癌中的甲基化情况尚不清楚。　　 Wnt信号通路是调节细胞增殖、分化等重要信号传导通路之一。Wnt通路中，Axin与GSK3和APC形成降解复合体，介导β-catenin的磷酸化和降解，从而将β-catenin蛋白表达量和Wnt通路活性控制在低水平状态。当β-catenin在核浆大量蓄积时，可与细胞核内的TCF/LEF转录因子结合，启动Wnt靶基因转录，进而促进肿瘤的恶性转化和侵袭转移。大量研究表明，Axin在肺癌中的表达明显减少，并与β-catenin的核蓄积和肺癌的低分化相关，Axin的表达水平可以作为判断肺癌患者预后和对放疗敏感性的有效指标之一。有学者认为Dab2通过PTB结构域，能够与低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)和蛋白磷酸酶1(PP1)竞争Axin的结合位点，从而稳定Axin蛋白、抑制其降解。我们推测:如果Dab2表达异常，就会削弱其对LRP5/6和PP1的竞争性作用，导致Axin蛋白降解增加，进而促进β-catenin蓄积和Wnt靶基因转录激活。　　 我们先前研究首次观察到Dab2不仅在细胞浆内表达，还可以进入细胞核，并且与Axin在肺癌组织中具有协同表达和共定位的现象。因此我们大胆推测Dab2在肺癌中表达明显下调，这种现象可能与Dab2异常甲基化有关，而且能引起Wnt通路的异常激活。本研究检测100例肺癌及相应癌旁正常肺组织中Dab2基因的启动子甲基化情况与Dab2的核、浆表达表达情况，分析其与肺癌临床病理因素的关系;且同时通过基因转染或SiRNA干扰的方法改变不同肺癌细胞系的Dab2表达，或者改变Dab2启动子甲基化状态，观察肺癌细胞的增殖侵袭能力的变化;探讨Dab2在肺癌发生发展中的作用，为肺癌基因治疗提供重要线索和理论基础。　　 材料与方法：　　 1、组织标本来源　　 100例新鲜肺癌及相应癌旁正常组织标本，均取自2010年11月～2012年2月期间在中国医科大学附属第一医院胸外科行肺部肿瘤切除术的肺癌患者，在-70℃冰箱保存。　　 2、细胞培养　　 本研究共采用8种肺癌细胞系。A549、H157、H1299、H460细胞系购自美国模式菌种收藏所(ATCC)，LTEP-a-2(LTE)、SPC、LK2细胞系购自中科院细胞库，BE1细胞系由北大郑杰教授惠赠，LK2和A549细胞系在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，其余的细胞在含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中培养(37℃，5％CO2)。　　 3、DNA提取与甲基化特异性-PCR(methylation specific-PCR，MSP)按照北京白太克公司的组织/细胞DNA提取试剂盒说明书提取DNA。准确定量后，按照EZ DNA甲基化试剂盒(ZYMO)说明书进行DNA样品甲基化修饰处理，获得DNA产物建立巢式PCR、MSP反应体系。将所得产物进行2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。全部实验均重复3次以上。　　 4、蛋白提取与Western Blot检测　　 随机提取50例已经通过MSP检测的肺癌与癌旁正常肺组织癌的浆蛋白与核蛋白，严格按照组织/细胞蛋白核浆分离试剂盒说明书进行标准操作。提取蛋白样品经BCA法定量，并稀释成相同浓度。取等量蛋白，进行10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和PVDF膜转印，一抗(anti-Dab2，anti-β-catenin，anti-β-actin，anti-Histone3.1均按照1∶500稀释)4度孵育过夜，辣根过氧化物酶标记二抗（鼠抗与兔抗均按照1∶5000稀释）孵育室温2h，ECL发光照相。对PVDF膜上出现的灰色条带进行灰度值测定，结果与β-actin（浆蛋白内对照）或者anti-Histone3.1（核蛋白内对照）的灰度值相除。　　 5、去甲基化处理　　 我们对H1299、LTE、A549细胞株进行去甲基化处理。分别加入终浓度5μmol/L的5’氮杂2-脱氧胞苷(5-Aza-dC)作为实验组，每24h换液并重新加药培养，连续处理72小时。不加5-Aza-dC的细胞作为对照组。　　 6、Dab2质粒转染与siRNA干扰　　 将pRK5-Dab2质粒转染入H1299、LTE、A549肺癌细胞系，按照Lipofectamine2000说明书的步骤进行，设立好对照组（空白组、空质粒转染组）。同样严格按照说明书将Dab2 siRNA转染入三种肺癌细胞，设立好对照组(control siRNA组与空白组)。转染或干扰72h左右后，提取各组细胞蛋白，检测其Dab2与β-catenin表达的变化情况。　　 7、MTS法检测细胞增殖　　 分别将转染或干扰24h、48h、72h、96h的各组细胞及对照组细胞接种于96孔板(2.0×105个细胞/孔)，使用MTS试剂盒检测细胞增殖情况。检测吸光度由microplate reader检测，波长490nm。单纯加DMSO试剂的孔作为测量值的内参对照，最终值为测量值减去内参对照值。　　 8、细胞侵袭能力检测　　 检测转染或干扰各组细胞及对照组细胞侵袭力的差异。24-well transwell板中小室的聚碳酸酯膜的孔径为8.0μm。先用无血清的DMEM培养基水化聚碳酸酯膜，后在膜的上表面铺基质胶(100μg/ml)，在转染或干扰24h后，将上述各组细胞接种在上室(5×105细胞/孔)，孵育30h后用PBS洗掉或棉签轻轻擦去上室底部或表面的细胞。再用多聚甲醛固定，苏木素染色。随机选取(10)个高倍镜视野进行细胞计数。　　 9、统计分析　　 各组资料利用SPSS17.0软件进行统计分析。P≤0.05有统计学意义。　　 结果：　　 1、肺癌组织中存在Dab2基因启动子高甲基化状态。Dab2基因启动子高甲基化与癌细胞分化程度有关(P＜0.001），组织学类型有关(P=0.006)，与肿瘤的淋巴结转有关(P=0.027)，与癌症TNM分期有关(P=0.043);与患者性别、年龄无关。　　 2、Dab2在肺癌和癌旁正常肺组织的胞核、胞浆中均有表达，在癌组织中的表达量明显低于癌旁正常肺组织（P＜0.05）。　　 3、肺癌组织细胞浆中Dab2表达量与Dab2基因启动子高甲基化成负相关(相关系数r=-0.258,P=0.009)，细胞核中Dab2表达量同样与启动子高甲基化成负相关(相关系数r=-0.298,P=0.003)　　 4、经过5-Aza-dC处理后，肺癌细胞系中Dab2的表达水平显著提高，β-catenin的表达明显下降，进而抑制肺癌细胞的增殖侵袭能力。　　 5、转染Dab2质粒后，肺癌细胞的胞浆、胞核内β-catenin的表达水平明显下降（P＜0.05），细胞的增殖侵袭能力减弱。　　 6、Dab2 siRNA干扰组的肺癌细胞-catenin表达水平明显上调，细胞增殖数与侵袭能力均明显高于空白组与乱序对照组细胞。　　 结论：　　 1、肺癌中Dab2基因启动子呈高甲基化状态，这种甲基化状态可被去甲基化试剂逆转。　　 2、肺癌中Dab2蛋白的胞浆与胞核表达量均下调，Dab2表达下调可激活Wnt信号通路，促进癌症的发生发展。　　 3、肺癌中Dab2基因启动子高甲基化是引起Dab2蛋白表达下调的主要原因，并可促进肺癌的发生发展。