深部静脉血栓症在世界范围内是一种致死率和致残率都相当高的疾病，其及时诊断和治疗显得尤为重要。临床上，医生常依据症状和体征得出初步判断，然后选用一些辅助检查如D一二聚体的检测、电阻抗体积描记检查辅助确诊。血栓的影像学检查因为其客观可靠性而逐渐成为一项常规的辅助诊断的手段。 在多种血栓影像学检查方法中，静脉造影因为能够直观呈现血栓部位和血流状态而被喻为“金标准”，但过敏症患者对造影剂敏感而引发的并发症预后是非常严重的，而且操作上也有技术困难：超声扫描是一项非常方便的非侵入性的检查，但是其敏感性比较差；螺旋CT和核磁共振血栓显像由于其技术上的难度和费用昂贵得不到广泛的应用；现有的放射性核素的检查对已确诊的病例诊断支持率低。特异安全的血栓定位显像还是一个亟待解决的问题。 血栓形成过程中，由纤维蛋白原转变的纤维蛋白是血栓骨架主要的蛋白质成分。利用抗原和抗体结合的特异性，制备特异的针对人纤维蛋白的抗体，然后对该抗体进行放射性核素标记，以期对体内的血栓进行特异的定位显像是进行体内血栓显像的一个思路。国内外针对抗人纤维蛋白的单克隆抗体的制备和血栓显像的研究都已经很丰富了，实验室和临床前动物实验也有较好的效果，但是应用于人体却存在异源蛋白大分子引发的人抗鼠抗体和体内清除缓慢的问题，此类问题的解决将为新型血栓显像剂的研制提供良好的技术支持。鼠源性单克隆抗体基因工程改造成单链抗体可以有效解决上述问题，但是随之而来的抗原抗体亲和力低和体内清除过快也将给临床应用造成困难。多项研究结果表明，使用非常规的短长度的连接肽可以得到功能状态下非共价结合的单链抗体的多聚体，抗原抗体的结合能力从而得到显著提高，体内清除率也随之下降。此类研究发现可能为临床血栓显像剂的研制提供新的思路和解决办法。 在本研究中，我们对本试验室保存的一株单克隆抗体杂交瘤细胞所分泌的高活性鼠抗人纤维蛋白单克隆抗体AFkβ8E5进行基因工程改造，制备成连接肽长度为5肽的单链抗体，旨在该单链抗体在活性状态下主要以非共价的二聚体的形式存在，从而有效地提高抗原抗体的结合能力，并使得体内清除率也下降，为临床血栓显像剂的研制提供新的思路和解决办法。我们首先从分泌鼠抗人纤维蛋白单克隆抗体AFkβ8E5的杂交瘤细胞中提取总RNA，逆转录合成cDNA第一链，参考经典文献合成通用简并引物，以之为模板扩增抗体轻链和重链可变区基因，扩增产物连入TA克隆载体pMD-19T，在Ecoli DH5α中克隆，并提取质粒，采用双脱氧链末端合成终止法进行测序，对测序结果进行互联网的序列同源性比对，验证为鼠源性的免疫球蛋白家族的轻链和重链的可变区基因后，重新合成带有限制性内切酶酶切位点和部分连接肽的引物，按VL-linker-VH方向，采用重叠延伸拼接法引入5肽的连接肽连接轻重链可变区基因，扩增产物连入TA克隆载体pMD-19T，在大肠杆菌DH5α中克隆，并提取质粒，测序验证无误后，通过酶切、连接，将单链抗体基因片段导入有组氨酸标签的原核表达载体pET28a(+)中，最后在Ecoli BL21(DE3)中实现初步表达，进行SDS-PAGE电泳和Western blot验证表达产物存在，并进一步优化了表达条件，为深入研究其生物学功能奠定了良好的基础。