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研究背景： 随着居民生活水平的提高，糖尿病在我国的发病率逐年提升，已然成为当前社会最主要的健康杀手。糖尿病是遗传因素和环境因素共同影响而引起的疾病，造成其病情恶化的最主要原因为胰岛β细胞的损伤和数目的减少。近年来发现，肾素-血管紧张素系统（Renin-angiotensin system, RAS）在局部胰腺组织中存在表达，更重要的是在糖尿病时RAS激活，致使其主要的效应物质，血管紧张素 II （Angiotensin II, Ang II）水平升高，而后者的过表达会引起胰岛功能紊乱和胰岛β细胞凋亡增加，但其具体机制尚不明确。 越来越多的研究证实，慢性炎症反应是导致糖尿病发生发展的重要因素。NLRP3炎性小体是一种多蛋白复合物，在各种病原刺激下发生活化，随后继续激活Pro Caspase-1，使其裂解为Caspase-1 p10活性片段，后者通过促进成熟的IL-1β的分泌而诱发细胞炎症损伤。关于NLRP3炎性小体的活化机制众说纷纭，但氧化应激引发ROS生成增多，进而促进TXNIP过表达或与NLRP3结合增多是其最主要的激活途径。因此，本研究旨在探讨Ang II发挥胰岛β细胞损伤作用是否通过TXNIP-NLRP3炎性小体通路而实现。 目的： 1. 使用Ang II刺激正常大鼠胰岛组织，观察其对胰岛β细胞分泌胰岛素水平的影响； 2. Ang II孵育正常大鼠胰岛及INS-1胰岛β细胞，观察其对胰岛细胞凋亡及NLRP3炎性小体表达的影响； 3. 探究Ang II影响NLRP3炎性小体表达的具体机制。 方法： 1. 动物实验：构建糖尿病大鼠模型，分离胰岛并检测Ang II水平； 2. 离体实验： （1）分离正常大鼠胰岛组织，使用Ang II刺激，ELISA法检测胰岛素分泌量； （2）Western Blot检测Ang II对胰岛凋亡及NLRP3炎性小体表达的影响； （3）CCK-8检测不同浓度（0、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L）及不同作用时间（0、6、12、24、48 h）的Ang II对INS-1胰岛β细胞存活率的影响； （4）流式细胞术及Western Blot检测Cleaved Caspase-3/Caspase-3，探究Ang II对INS-1胰岛β细胞凋亡的影响； （5）Western Blot检测Ang II作用下INS-1胰岛β细胞NLRP3炎性小体、TXNIP、ChREBP、AT1R的表达情况； （6）RT-PCR检测Ang II对INS-1胰岛β细胞TXNIP、ChREBP的mRNA水平的表达影响； （7）IF/ICC法观察Ang II处理对INS-1胰岛β细胞TXNIP、ChREBP及AT1R的表达影响。 结果： 1.糖尿病鼠胰岛组织中Ang II含量升高 分离糖尿病鼠胰岛，ELISA实验检测胰岛中Ang II含量的结果显示，T1DM组Ang II水平显著上调（P<0.01, n=7）；T2DM组的Ang II含量也明显升高（P<0.01, n=7）。（见图1） 2. Ang II对原代胰岛的功能及蛋白表达的影响 2.1 Ang II可以降低胰岛β细胞的胰岛素分泌水平 检测胰岛功能显示，Ang II组葡萄糖刺激的胰岛素分泌指数降低（P<0.05, n=6），说明Ang II造成胰岛功能受损。（见图2A-C） 2.2 Ang II可以诱导胰岛细胞凋亡 Western Blot结果表明，与对照组相比，Ang II组Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值升高（P<0.01, n=6），提示Ang II诱导胰岛细胞凋亡增加。（见图2D） 2.3 Ang II可以激活胰岛细胞NLRP3炎性小体 与对照组相比，Ang II组的NLRP3、ASC、Caspase-1的活性片段p10的蛋白表达均升高（P<0.01, n=6;P<0.01, n=6;P<0.05, n=6），培养液中IL-1β的分泌增多（P<0.01, n=6）,说明Ang II可引起NLRP3炎性小体的激活。（见图2E、F） 3. Ang II 诱导INS-1胰岛β细胞存活率下降 CCK-8结果显示，随着Ang II作用浓度的升高，INS-1胰岛β细胞存活率逐渐下降，在1×10-6mol/L时作用显著（P<0.01, n=6）；给予INS-1胰岛β细胞孵育Ang II不同时间，发现随着Ang II作用时间的延长，细胞存活率逐渐降低，Ang II作用24 h时细胞活力显著下降（P<0.01, n=6）。（见图3） 4. Ang II促进INS-1胰岛β细胞凋亡 流式细胞术结果显示，Ang II组细胞凋亡率相比对照组升高（P<0.05, n=6）。Western Blot方法检测Caspase-3及Cleaved Caspase-3，Ang II组Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值升高（P<0.05, n=6）。（见图4） 5. Ang II 通过NLRP3炎性小体诱导INS-1胰岛β细胞凋亡 与对照组相比，Ang II组NLRP3、ASC的蛋白表达均上调（P<0.05, n=6）， Caspase-1的活性成分p10片段表达明显升高（P<0.05, n=6），细胞培养上清的IL-1β分泌量显著升高（P<0.01, n=6）。（见图5A、B） NLRP3炎性小体的活化抑制剂MCC950（1×10-5mol/L），抑制了NLRP3炎性小体的活化后，Caspase-1 p10片段蛋白表达显著下调（P<0.01, n=6）、细胞上清中IL-1β分泌量也显著减少（P<0.01, n=6）。同时，与Ang II组相比，MCC950+Ang II组Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值显著降低（P<0.01, n=6）。说明Ang II可通过激活NLRP3炎性小体诱导INS-1胰岛β细胞凋亡。（见图5C、D） 6. TXNIP介导Ang II 诱导的NLRP3炎性小体的表达及胰岛β细胞凋亡 Ang II刺激INS-1胰岛β细胞引起TXNIP的mRNA和蛋白水平表达上调，且具有浓度依赖性和时间依赖性，在1×10-6mol/L时升高程度显著（P<0.01, n=6）；Ang II作用24 h时TXNIP表达升高的程度明显（P<0.05, n=6）；Ang II（1×10-6mol/L, 24 h）处理INS-1胰岛β细胞，免疫细胞化学染色后发现，Ang II组胞质内TXNIP表达增多。（见图6A-E） 通过TXNIP shRNA感染INS-1细胞，抑制TXNIP的表达后可见，与Scramble shRNA+Ang II组相比，TXNIP shRNA+Ang II组NLRP3、ASC、Caspase-1 p10蛋白表达显著下调（P<0.01, n=6），Cleaved Caspase-3/Caspase-3显著降低（P<0.01, n=6），上清IL-1β含量降低（P<0.01, n=6）。提示，TXNIP参与介导了Ang II活化NLRP3炎性小体及INS-1细胞凋亡。（见图6F-I） 7. ChREBP参与Ang II诱导INS-1细胞凋亡 Ang II刺激INS-1细胞后，与对照组相比，Ang II组ChREBP的mRNA和蛋白表达水平均上调（P<0.05, n=7）。免疫荧光结果显示，Ang II组ChREBP表达高于对照组，且从细胞质内表达变为细胞核内表达，提示ChREBP被Ang II激活，并且表达增多。（见图7） 8. AT1R介导Ang II引发的NLRP3炎性小体活化及INS-1胰岛β细胞凋亡 Western Blot结果显示，Ang II组AT1R蛋白表达水平相比对照组明显升高（P<0.05, n=6）。免疫荧光结果示，Ang II组AT1R红色荧光明显多于对照组。（见图8A、B） 使用AT1R特异性的抑制剂替米沙坦预处理INS-1细胞1 h（1×10-5mol/L）， TM+Ang II组细胞活力明显增强（P<0.01, n=6），Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值低于Ang II组（P<0.05, n=6）。说明AT1R介导Ang II降低INS-1细胞活力以及诱导细胞凋亡的过程。（见图8C、D） 为进一步探究AT1R在Ang II引起NLRP3炎性小体活化和TXNIP表达升高过程中的作用，我们观察了替米沙坦作用后NLRP3炎性小体、TXNIP、ChREBP的表达情况。结果显示，与Ang II组相比，TM+Ang II组NLRP3、ASC蛋白表达下调（P<0.05, n=6）、Caspase-1 p10片段表达降低（P<0.05, n=6）、细胞培养上清中IL-1β含量明显减少（P<0.01, n=6）；同时，TXNIP的mRNA和蛋白水平均明显降低（P<0.01, n=6）、ChREBP mRNA和蛋白水平上调也被替米沙坦抑制（P<0.05, n=6）。综上所述，Ang II通过AT1R发挥影响INS-1细胞的下游作用。（见图8E-J） 结论： 1. Ang II可以抑制胰岛素分泌，促进胰岛β细胞凋亡； 2. TXNIP-NLRP3炎性小体通路介导Ang II诱发的INS-1胰岛β细胞凋亡增加； 3. AT1R介导Ang II引发的NLRP3炎性小体活化及INS-1胰岛β细胞凋亡。