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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)是造成断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)等相关疾病的重要病原,目前已呈全球分布。为了解PCV2在珠三角地区的流行情况,以及PCV2珠三角地方株的牛物学特性,本研究在2009～2010年间从珠三角地区的猪场采集疑似PMWS病死的猪的临床病料,参照GenBank上已发表的PCV2的全基因组序列设计合成一对特异性引物,利用PCR的方法在临床病料中扩增出PCV2的。DNA片段。将阳性组织匀浆液接种于PK-15细胞,每代细胞毒经PCR检测均为阳性。第7代细胞毒经间接免疫荧光检测后,可在接毒细胞内观察到特异性免疫荧光,说明已经分离到PCV2毒株,共有13个毒株。
根据GenBank上已发表的PCV2的全基因组序列设计两对引物,扩增PCV2的全基因组序列,应用DNA Start软件将其与其他PCV2毒株进行氨基酸和核苷酸同源性比较,序列分析表明,病毒全基因组长1767 bp,包含11个开放阅读框,与其他PCV2株的核苷酸序列同源性介于93.4％～99.8%,分离株之间核苷酸序列相似性为94.2%～99.8%。其中ORF1比较保守,核苷酸序列同源性为95.1%～99.9%,氨基酸序列同源性介于94.9%～100%之间;ORF2序列差异较大,核苷酸序列同源性为88.6%～100%,氨基酸序列同源性为87.2%～100%。
根据GenBank登录的PCV2序列,应用生物学软件进行序列比对,在PCV2的ORF2的保守区,设计了引物和TaqMan探针,制备了PCV2阳性样品,成功建立了PCV2的TaqMan荧光定量PCR方法。用此方法对PCV2病毒样品的检测有特异性扩增曲线,而对PRRSV、PCV1、PRV、FMDV、CSFV检测均无扩增曲线,说明其有良好的特异性;与常规PCR进行敏感性比较,检测出了常规PCR方法不能检出的阳性样品,且敏感性比常规PCR高100倍,说明其具有较高的敏感性;重复性实验表明其变异系数较小,具有良好的重复性和稳定性。总之,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,对PCV2的快速检测具有实际的应用价值。
采集病猪的淋巴结、肝脏、肺脏、心脏、脾脏和肾脏,先进行常规PCR定性检测,然后再用。TaqMan荧光定量PCR方法进行定量检测。结果表明PCV2在自然感染的猪体中广泛存在。其中以淋巴结、肾脏的病毒含量最多,其次是肺脏、脾脏和肝脏,最低是心脏。这说明PCV2引起的PMWS是一种免疫抑制病,病毒主要在免疫细胞中繁殖,导致淋巴细胞的损害和消耗,而且对肾脏的损害也十分大,结果与临床症状及病理病变结果符合,为PCV2的致病机理的研究奠定基础。