论文部分内容阅读
生物材料和组织工程支架材料在用于医疗修复或器官替代中需要其具有良好的生物相容性。材料的生物相容性体现在材料表面与吸附于其上的蛋白的相互作用。材料表面吸附蛋白的种类、数量和构象变化都对后期的细胞粘附和组织形成起了一定的介导作用。本文运用金-硫醇自组装单分子层（Self-AssembledMonolayer,简称SAM)技术，构建了不同化学基团（-NH2、-COOH、-OH和-CH3）修饰的材料表面。采用X射线光能质谱（XPS）表征了材料表面化学组成，静态水接触角测定材料表面的亲/疏水性。运用BCA蛋白定量测定技术和免疫组化法测定了预吸附于SAM表面上纤连蛋白的吸附量和构象。采用体外细胞培养法，以SD大鼠颅骨成骨细胞为模型细胞，以聚苯乙烯（TCPS）和纯金表面为对照，将细胞与各SAMs表面复合培养，从细胞增殖、分化与矿化能力等方面考查了经过蛋白质处理过后的SAM表面与成骨细胞的细胞相容性；同时，考查了SAM表面对成骨细胞整合素-细胞骨架网络系统的影响，从而更综合的评价了材料表面吸附蛋白对后期的细胞粘附和增殖形成的一定的介导作用。主要工作和结论如下： (1)不同化学基团SAM表面的制备及表面化学组分和亲/疏水性测定：通过金-硫醇自组装单分子层技术制备了四种不同化学基团的SAM表面，即-CH3、-OH、-COOH、-NH2。XPS技术定性检测了材料表面化学组分。采用静态水接触角评价了材料的亲/疏水性能。结果表明，-OH与-COOH为亲水性表面，分别为17°和25°，-NH2为中性表面，水接触角为49°，-CH3为强疏水性表面，为105°。 (2)SAM表面对纤连蛋白的吸附量和吸附构象的影响：采用BCA蛋白定量法分别测定了不同浓度下，纤连蛋白在不同表面化学性质材料上的吸附量。结果表明，纤连蛋白在25μg/mL的浓度下，-OH表面上为113ng/cm2，单位面积上吸附的蛋白质量最低；-NH2与-CH3表面分别达到了437ng/cm2与349ng/cm2；-COOH表面为264ng/cm2、TCPS表面为386ng/cm2、Au表面为209ng/cm2。FN为40ng/cm2时，亲水性表面-OH对FN构象变化影响较其他表面低，强疏水性表面-CH3对FN构象变化影响最大。 (3)成骨细胞原代培养及鉴定：采用组织块法培养出生1-3天的SD大鼠颅骨成骨细胞，利用差时贴壁法去除成纤维细胞，对成骨细胞进行有效纯化。通过形态观察、ALP染色鉴定表明具有成骨细胞的典型生物学行为。 (4)表面化学刺激对成骨细胞增殖、分化和矿化的影响：以SD大鼠颅骨成骨细胞为模型细胞，以TCPS为对照，将成骨细胞与SAMs复合培养，考查了成骨细胞在不同SAMs上的增殖、分化和矿化能力。MTT结果表明，细胞在-OH和-NH2表面增殖能力都优于其他材料，相对平均细胞增殖能力-NH2组>-COOH组>TCPS组>-OH组>-CH3组>Au；ALP结果表明，细胞培养1-7天，各基底表面ALP活性较低，分化程度低；随着培养时间的延长，各培养组的ALP活性均有增加，但在培养了7-17天时，各组材料的ALP活性仍不及TCPS；细胞培养19天，-OH和-CH3组ALP活性最强；矿化结节定量检测结果显示，细胞培养21天，各组基底材料均能促进成骨细胞矿化结节的形成，与TCPS比较，-CH3、-NH2和-COOH组差异显著（P<0.005），其中，-CH3组的差异最为明显（P<0.005）。 (5)表面化学刺激对成骨细胞细胞骨架和整合素的影响：模型细胞采用SD大鼠颅骨成骨细胞，以TCPS为对照，成骨细胞培养在各基质表面上，考查了成骨细胞在不同SAMs上的铺展和整合素分泌情况。结果表明，-CH3促进细胞在材料上的铺展，细胞中肌动蛋白纤维排列整齐有序，但其整合素分泌较少；-OH整合素分泌最多，细胞铺展较充分。 综上所述，SAMs表面通过刺激预吸附蛋白纤连蛋白的构象发生变化，将自身表面化学性质作为一种生物语言传递给细胞上的整合素-细胞骨架网络系统，介导细胞的粘附、增殖、分化、铺展和矿化等行为。与TCPS相比，亲水性-OH和-COOH表面对纤连蛋白的构象影响最低，促进成骨细胞的增殖、分化和矿化；中性-NH2表面在溶液状态下，表面提供了一个正电荷，更有效的将带负电的细胞粘着于材料表面，从而促进细胞增殖和分化；疏水性-CH3表面纤连蛋白构象改变最大，不利于细胞的增殖和分化，却有利于细胞的铺展，并诱导细胞矿化。