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银杏酮酯(GBE50)是我国自主开发的第四代新型银杏叶提取物制剂,用于治疗冠心病、心绞痛和脑动脉硬化、眩晕,有良好的疗效,但其作用机制有待研究。本文在离体和在体的两种实验条件下,采用常规微电极、膜片钳、激光共聚焦、形态学及分子生物学等技术与方法观察银杏酮酯(GBE50)对正常及缺血心肌电生理的效应并进一步研究其抗心肌缺血钙超载效应及其机制。
一、银杏酮酯(GBE50)对正常豚鼠心肌的电生理作用
1.对心肌跨膜电位的影响:GBE50缩短心室乳头肌APD,与加药前相比,10和20mg·L-1GBE50缩短APD90,5、50和100mg·L-1 GBE50缩短APD50、APD90,呈剂量依赖性效应。2.对心室肌细胞跨膜电流的影响:100mg·L-1 GBE50减小延迟整流钾电流(IK);50和100mg·L-1GBE50可减小L型钙电流(Ica-L)。3.对心室肌细胞内游离钙浓度的影响:用50mg·L-1 GBE50灌流12min,心肌细胞内游离钙浓度减少。
二、银杏酮酯(GBE50)抗心肌缺血的电生理研究
1.对缺血心肌跨膜电位的影响:与对照组相比,模拟缺血液可引起豚鼠心室乳头肌细胞APD缩短、RP除极及APA降低,对APD的抑制作用最为明显。缺血液中加入100mg·L-1 GBE50后观察到,GBE50可减弱或部分逆转缺血对心室肌细胞AP的抑制效应;2.对缺血心肌跨膜电流的影响:模拟缺血溶液显著抑制Ica-L,50mg·L-1 GBE50则可部分逆转缺血Ica-L的抑制效应;在模拟缺血条件下,IK明显被抑制,50、100mg·L-1 GBE50可部分逆转模拟缺血所致的IK的减少;模拟缺血可开放K-ATP,50mg·L-1 GBE50可促进缺血时K-ATP开放;3.对缺血心肌细胞内游离钙浓度的影响:模拟缺血液使豚鼠游离单个心室肌细胞内游离钙浓度增加,50mg·L-1 GBE50可减小缺血后心肌细胞内游离钙的浓度,减轻缺血后心肌细胞内钙超载。
三、银杏酮酯(GBE50)对在体急性心肌缺血模型大鼠的影响及钙超载作用探讨
1.通过在体大鼠心脏动力学实验显示,心肌缺血可抑制心脏的舒缩功能,LVSP明显降低,LVEDP显著升高,+dp/dtmax、-dp/dtmax显著降低,而丹参(7.5g/kg/d×7)和GBE50(100mg/kg/d×7)均能明显改善缺血后舒张功能,对收缩功能在缺血早期有所改善,但在缺血中后期无明显改变。2.缺血3h后TTC染色结果显示:丹参和GBE50皆可减少冠脉结扎大鼠心肌缺血危险区面积百分比。3.缺血24h后光镜和扫描电镜观察显示:心肌缺血导致大鼠心室肌细胞超微结构出现明显损伤,丹参和GBE50能改善心肌细胞超微结构的变化,对抗缺血所致心肌细胞超微结构的损伤,减轻线粒体损伤的作用尤为明显。4.缺血3h后钙调控蛋白表达结果显示:模型组心肌组织中NCX上调,LTCC、RyR2、SERCA2a下调,而丹参和GBE50均可减轻以上蛋白的异常表达,尤其是GBE50可显著减少NCX的上调。
综上所述,我们得出以下结论:在离体水平,
1.GBE50可缩短正常心肌细胞APD,减小跨膜电流(Ica-L,IK)和降低细胞内游离钙浓度;
2.模拟缺血抑制心肌细胞.AP和跨膜电流(Ica-L,IK),GBE50可减轻缺血的抑制效应,增强IK-ATP;
3.对心肌细胞游离钙的测定发现GBE50可减轻缺血后心肌细胞内钙超载;在整体水平,
1.GBE50可明显改善急性心肌缺血模型大鼠心脏舒张功能;
2.GBE50可减少心肌缺血危险区面积,改善缺血所致心肌细胞超微结构的损伤;
3.GBE50可减轻心肌缺血时钙调控蛋白(LTCC,RyR2,SERCA2a,NCX)的异常表达,尤其是显著减少NCX的上调。
总之,GBE50可减轻缺血对心肌动作电位和跨膜电流的抑制,具有抗心肌缺血钙超载效应,其机制与GBE50可减轻缺血心肌钙调控蛋白的异常表达有关。
本研究有望为GBE50运用于防治缺血性心脏病及其作用机制增添新的理论和实验依据,至少在1)GBE50对模拟缺血豚鼠心肌细胞钙超载的抑制;2)通过对离子流的观测证实GBE50诱导缺血豚鼠心肌细胞K-ATP开放;以及3)GBE50减轻心肌缺血大鼠心肌钙调控蛋白的异常表达等方面有所创新。GBE50的抗心肌缺血作用是多靶点的,其进一步的机制有待深入研究。