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呼吸道合胞病毒(RSV)是引起婴幼儿呼吸道感染最重要的病毒,几乎所有婴幼儿在生后头三年都感染过RSV。RSV下呼吸道感染(RSV-LRTI)是诱发婴幼儿第一次喘息和导致婴幼儿住院最常见的原因,临床观察和研究也发现,婴幼儿急性RSV-LRTI后常发生反应性气道疾病(RAD),在急性期过后的相当长时间内出现反复喘息发作,且目前发现,RSV-LRTI与哮喘发病密切相关。目前有关RSV感染导致急性喘息及气道慢性组织病理学改变从而导致后续RAD和慢性哮喘的分子生物学机制均不明确,临床上对RSV相关喘息尚缺乏特效防治方法。由于RSV感染相关喘息的临床表现与支气管哮喘相似,临床上常用全身用或吸入糖皮质激素防治RSV相关喘息,但目前有不少随机、双盲、安慰剂对照研究对其疗效提出质疑。有关RSV相关喘息对糖皮质激素反应欠佳的确切机理目前尚不清楚,推测可能与婴幼儿RSV相关喘息中存在糖皮质激素不能有效抑制的细胞因子及炎症介质有关。目前研究提示,半胱氨酰白三烯(CysLTs)在RSV相关喘息中可能起重要作用,RSV感染患儿体内CysLTs水平增高,且其浓度与病情严重度相关,且目前尚有少量研究提示,CysLTs参与了气道重塑和BHR的形成。目前有关糖皮质激素能否有效抑制CysLTS合成和释放尚无明确结论,不少研究提示糖皮质激素不能有效抑制CysLTs合成和释放。基于RSV感染是诱发婴幼儿第一次喘息最常见的原因及其与哮喘发病密切相关,推测RSV感染时可能通过促进CysLTs分泌诱发急性喘息并同时启动气道重塑的过程,引起气道慢性组织病理学改变,为后续RAD及持续性哮喘的发生提供了病理生理基础。既往认为CysLTs仅来源于髓系细胞,但目前证实气道结构细胞如气道上皮细胞可产生CysLTs。气道上皮细胞,是气道与外界环境接触的第一道防线,是RSV感染时首先接触和攻击的主要靶目标,推测RSV感染气道上皮细胞时,上调了气道上皮细胞CysLTs的合成,引起气道平滑肌收缩,并肩动了气道炎症及气道重塑过程,从而导致急性喘息及气道慢性组织病理学改变。
目的：
1.通过系列观察RSV不同MOI和不同感染时间感染支气管上皮细胞株(16-HBE)的CPE改变,探讨RSV感染16-HBE最佳条件以成功建立RSV感染16-HBE的体外模型,为进一步系统探讨RSV感染分子生物学机制提供有效的体外研究细胞模型；
2.观察RSV感染对人支气管上皮细胞株(16-HBE)LTC4S mRNA表达水平和CysLTs合成分泌水平的影响,以及吸入糖皮质激素(布地奈德,BUD)对RSV感染诱导气道上皮细胞CysLTs合成的影响,探讨婴幼儿RSV感染相关喘息的发病机制及有效的防治方法；
3.通过气道上皮细胞与上皮下间充质细胞复合培养模型,观察RSV感染支气管上皮细胞对上皮下间充质细胞LTC4S mRNA表达水平和CysLTs、内皮素-1(ET-1)和转化生长因子-β1(TGF-β1)合成合成水平的影响及白三烯受体拮抗剂对该过程的抑制作用,探讨RSV感染启动气道重塑的分子生物学机制,为儿童哮喘有效早期预防药物的选择提供理论依据。
方法：
1.细胞培养和RSV传代、冻存、定量：培养实验所需的人喉癌上皮细胞株(HEp-2)、人气道上皮细胞株(16-HBE)和原代支气管成纤维细胞(HPBFs)。以RSV易感的HEp-2进行病毒的繁殖、传代、冻存,空斑技术测定病毒感染单位量。
2.RSV感染16-HBE体外模型的建立：16-HBE细胞以104/ml分种于96孔培养板,50ul/孔待细胞70％汇合后,以MOI分别为0.001、0.01、0.1、1.0和10 RSV接种,动态观察接种24h、48h、72h、96h、120h后16-HBE细胞形态学改变,细胞增殖活性实验检测细胞增殖活性(GI),并以RT-PCR法检测16-HBE细胞中RSV病毒核酸和直接免疫荧光技术察知病毒相应抗原在感染细胞内的定位。
3.RSV对16-HBE CysLTs合成及其主要限速酶LTC4S表达的影响：实验分16-HBE组(不加病毒)和RSV感染组,感染组分为16-HBE-RSV(0.001)组、16-HBE-RSV(0.01)组、16-HBE-RSV(0.1)组、16-HBE-RSV(1.0)组和16-HBE-RSV(10)组,以MOI分别为0.001、0.01、0.1、1.0、和10 RSV接种于6孔板中以长至85％融合的16-HBE。感染24h、48h、72h、96h、120h收集上清液和细胞,应用竞争性酶连免疫吸附试验(ELISA)检测上清液CysLTs水平和荧光定量PCR法检测LTC4SmRNA表达水平。LTC4SmRNA表达水平以qCt值表示,qCt值与LTC4SmRNA表达水平成反比。
4.BUD对RSV感染16-HBE CysLTs合成和LTC4S mRNA表达水平的影响：将16-HBE接种于6孔板,实验分16-HBE组、16-HBE-RSV组(RSV MOI为0.1)和16-HBE-RSV+BUD(10-10)组(RSV MOI为0.1,加入BUD 10-10mmol/L)、16-HBE-RSV+BUD(10-8)组(RSV MOI为0.1,加入BUD10-8mmol/L)、16-HBE-RSV+BUD(10-6)组(RSV MOI为0.1,加入BUD 10-6mmol/L)、16-HBE-RSV+BUD(10-5)组(RSV MOI为0.1,加入BUD 10-5mmol/L)。病毒吸附2小时后弃去,各BUD组再加入不同浓度的BUD,第3天收获细胞和上清液,检测上清液CysLTs水平和细胞LTC4SmRNA表达水平。
5.RSV对复合培养的16-HBE与HPBFsCysLTs、ET-1和TGF-β1合成和LTC4S mRNA表达水平的影响及孟鲁司特(Montelukast)对此过程可能存在的抑制作用:HPBFs以1×l05/well接种于6孔板,同时16-HBE细胞以大致相同的密度接种于培养小室,以MOI=0.1将RSV接种于16-HBE,吸附2小时将培养小室放入培养有HPBFs的6孔板中。实验分组：16-HBE组、HPBFs组、16-HBE+HPBFs组、16-HBE-RSV(0.1)组、16-HBE-RSV(0.1)+HPBFs、16-HBE-RSV(0.1)+HPBFs+Montelukast(10-6mol/L)组,复合培养72h后收集上清液和细胞,检测上清液CysLTs、ET-1和TGF-β1水平和细胞LTC4SmRNA表达水平。
结论：
1.RSV可成功感染人支气管上皮细胞株(16-HBE),但受RSV感染的16-HBE仅出现细胞胞体增大,透亮度降低,坏死细胞增多呈聚集状,不形成典型融合病变,MOI为0.1和感染时间为72h是RSV感染16-HBE最佳条件；
2.RSV感染人支气管上皮细胞可明显上调LTC4S mRNA表达水平和CysLTs合成分泌水平,该表达和分泌水平增高约在感染后72h达高峰,与临床资料显示的RSV--LRTI患儿临床症状通常在感染后72小时达高峰相一致,提示RSV感染诱导支气管上皮细胞CysLTs合成表达水平增高可能是其引发急性喘息的主要分子生物学机制之一。
3.吸入糖皮质激素BUD不能有效抑制RSV感染诱导的支气管上皮细胞LTC4S mRNA表达的上调和CysLTs合成水平的增高,这可能是糖皮质激素对婴幼儿RSV感染急性喘息疗效不明确的原因。
4.RSV感染人支气管上皮细胞与上皮下成纤维细胞复合培养时可诱导上皮下成纤维细胞LTC4S mRNA表达水平上调,促进CysLTs和主要生长因子TGFβ-1和ET-1合成的增加。
5、白三烯受体拮抗剂可明显下调RSV感染人支气管上皮细胞诱导的上皮下成纤维细胞LTC4S mRNA表达水平增加和有效抑制CysLTs、TGFβ-1和ET-1合成。
6、RSV感染上调气道结构细胞CysLTs合成,从而促进TGF-β1和ET-1等生长因子合成可能是RSV感染易感个体启动气道重塑的分子生物学途径之一。