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研究背景:骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是由于多种因素导致的骨结构破坏和骨质量下降,造成骨组织脆性增加,从而容易发生病理性骨折的全身性骨病。特发性骨质疏松、绝经后骨质疏松和老年性骨质疏松是原发性骨质疏松的三种主要类型。随着人们生活质量的提高,人类平均年龄逐渐增加,人口老龄化现象已成为全球公共卫生事业面临的严峻问题。资料显示,我国60%中老年人遭受骨质疏松症的危害,骨质疏松症好发于65岁以上的人群,严重影响患者的生活质量,给患者家庭造成超负荷的经济负担。在骨代谢中,成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收之间失衡引起骨组织重构紊乱是骨质疏松形成的重要病理过程,该过程受到遗传因素(如基因多态性)和坏境因素(饮食、吸烟、职业性暴露环境污染物)的共同调控。良好的生活习惯,药物如钙剂、激素替代药物治疗能有效预防骨质疏松的形成、降低骨质疏松症的发生风险。然而,骨质疏松骨折引起的残疾和死亡仍然是导致老年人生命和生活质量降低的重要原因,目前老龄骨质疏松症的病因学机制尚不完全清楚。在骨重建过程中骨形成功能性障碍是骨质疏松症的主要病理机制,成骨细胞和脂肪细胞的分化失衡导致骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal cells,BMSCs)数量减少从而引起骨折愈合障碍是老年性骨质疏松发病的原因之一。在骨形成过程中,成骨前体细胞主要来源于骨髓中的骨髓间充质干细胞,而BMSC细胞的成骨分化能力是影响骨形成、骨质量和骨数量的关键因素。因此,增强骨质疏松症患者BMSC细胞的成骨分化潜能,揭示BMSC细胞成骨分化的分子机制是深入探索骨质疏松症诊断和治疗的关键。辛伐他汀(Simvastatin,SIM)是他汀类药物家族重要成员之一,大量研究表明辛伐他汀能抑制成骨细胞凋亡、促进间充质干细胞向成骨细胞分化。辛伐他汀在再生医学中的重要作用受到越来越多的关注,然而辛伐他汀的用药方式、给药剂量及药物反应仍没有明确定义,辛伐他汀诱导MSC细胞成骨分化的作用机制仍不完全清楚。Wnt/β-catenin信号通路在间充质干细胞和成骨细胞中高表达,参与调控MSC细胞的成骨分化,在成骨前体细胞的增殖和终末分化中发挥重要作用。激活Wnt/β-catenin信号通路可促进成骨细胞矿化、抑制成骨细胞凋亡。辛伐他汀具有促进间充质干细胞增殖、诱导间充质干细胞向成骨细胞分化的功能,其机制与MAPK/Akt、TGFβ/Smad3、Hedgehog/Glil等信号通路的激活有关。然而,Wnt/β-catenin信号通路在辛伐他汀诱导BMSC细胞增殖和成骨分化中的生物学意义尚不清楚,Wnt/β-catenin信号通路是否参与调控辛伐他汀诱导BMSC细胞的成骨分化尚无研究报道。本研究在体外观察辛伐他汀对BMSC细胞成骨分化的影响,探讨Wnt/β-catenin信号通路在辛伐他汀诱导BMSC细胞成骨分化中的作用。研究目的:1.体外观察辛伐他汀对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响,探讨Wnt/β-catenin信号通路在辛伐他汀诱导BMSC细胞成骨分化中的作用。2.揭示辛伐他汀诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的分子机制,为靶向Wnt/β-catenin通路激动剂联合辛伐他汀治疗骨相关疾病提供理论依据。研究方法:1.6-8周龄清洁级SD大鼠经脱臼处死,采用全骨髓贴壁培养法和酶消化法分离BMSC细胞进行原代和传代细胞培养;2.流式细胞仪检测BMSC细胞表面CD29、CD90、CD34和CD45的表达,将第3代BMSC细胞经不同剂量的(0、0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0 nmol/L)辛伐他汀作用不同时间,运用CCK8法、Annexin V/PI染色法和流式细胞仪测定BMSC细胞增殖和凋亡;3.BMSC细胞经0.3 nmol/L辛伐他汀诱导培养,以DMSO处理7天的BMSC细胞为对照组,分别在给药后第3天、7天、14天和21天进行茜素红染色(Alizarin red staining,ARS);收集细胞培养上清,运用紫外分光光度计测定各组在570 nm处的吸光度值,计算钙盐含量、ALP活性以及茜素红阳性染色面积;0.3 nmol/L辛伐他汀作用BMSC细胞7天时进行碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色。4.辛伐他汀作用BMSC细胞后收集细胞培养上清,酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定 ALP 和骨形态生成蛋白-2(Bone morphogenetic protein,MBP-2)的浓度;收集 BMSC 细胞,运用Real time PCR 和 Western blot 分别检测 BMP-2、骨钙蛋白(Bone gla protein,Bglap)、成骨细胞特异性转录因子(OSX)、Runx2、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)以及 β-catenin、AKT、JNK 的 mRNA和蛋白表达;5.第3代BMSC细胞转染荧光素酶-报告基因质粒,再经0.3 nmol/L辛伐他汀作用48 h,运用紫外分光光度法测定β-catenin启动子活性;6.第3代BMSC细胞经0.3 nmol/L辛伐他汀诱导7天,运用免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测β-catenin的蛋白表达和核转移;7.构建shβ-catenin/BMSC和shLuc/BMSC稳定细胞系,运用脂质体2000试剂法将siβ-catenin和siNC转染BMSC细胞,再经0.3 nmol/L辛伐他汀单独或联合 HLY87(Wnt/β-catenin 通路激动剂)或 DDK1(Wnt/β-catenin 通路抑制剂)作用shβ-catenin和shLuc-BMSC细胞,培养7天时进行茜素红染色;Western blot检测β-catenin、ALP及BMP-2的蛋白表达;紫外分光光度法测定ALP活性,ELISA检测BMSC细胞培养上清中ALP和BMP-2的含量。研究结果:1.BMSC细胞的分离和鉴定流式细胞仪结果显示,BMSC细胞表面间充质干细胞标志物CD29的阳性细胞率分别为(98.5±1.6)%、CD90的阳性细胞率为(97.2±1.7)%,造血干细胞标志物CD34和CD45的阳性率分别为(3.3±1.5)%和(2.8±0.8)%;与骨髓间充质干细胞表面抗原表型相符,本研究成功建立了 BMSC细胞。2.辛伐他汀对BMSC细胞增殖和细胞凋亡的影响CCK8和Annexin V/PI染色法结果显示:0.01-0.3 nmol/L的辛伐他汀对BMSC细胞增殖无影响;当伐他汀浓度≥1 nmol/L时,与DMSO组(0 nmol/L)比较,辛伐他汀呈时间和剂量依赖性方式显著促进BMSC细胞增殖(P<0.05);0.3 nmol/L的辛伐他汀对细胞凋亡无明显影响,而1 nmol/L和3 nmol/L的辛伐他汀略微诱导细胞凋亡(P>0.05)。3.辛伐他汀对BMSC细胞成骨分化的影响茜素红染色:与对照组(DMSO)细胞比较,辛伐他汀处理组细胞橘红色矿化结节显著增加(P<0.05),具有时间依赖效应;ALP染色:与对照组比较,辛伐他汀处理组细胞中红棕色颗粒明显增多,辛伐他汀处理组细胞培养上清中的ALP活性显著高于对照组(P<0.05);ELISA结果显示,与DMSO组比较,辛伐他汀处理组细胞培养上清中ALP和BMP-2的浓度显著增加(P<0.05),具有时间依赖关系。4.辛伐他汀对成骨分化相关基因mRNA和蛋白表达的影响Real time PCR和Western blot结果显示:辛伐他汀处理组细胞中BMP-2、Bglap、OSX、Runx2、OPN及OCN的mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05),具有时间依赖效应。5.辛伐他汀对Wnt/β-catenin、AKT及JNK信号通路的影响Real time PCR和Western blot结果显示,辛伐他汀呈时间依赖性促进β-catenin的mRNA和蛋白表达;辛伐他汀明显激活磷酸化AKT(pAKT)蛋白表达,而DMSO和辛伐他汀处理细胞中AKT和JNK的mRNA和蛋白表达水平无统计学差异(P<0.05)。6.辛伐他汀诱导BMSC细胞成骨分化的分子机制荧光素酶-报告基因结果显示,与DMSO处理组比较,0.3 nmol/L的辛伐他汀显著增加荧光素酶活性(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示,对照组细胞中的β-catenin主要在细胞核中表达,少量表达于细胞质,辛伐他汀处理组细胞中的β-catenin仅在细胞核中表达,细胞核中的β-catenin水平显著高于DMSO 组(P<0.0001)。7.Wnt/β-catenin信号通路在辛伐他汀诱导BMSC细胞分化中的作用Western blot结果显示,与siNC细胞比较,siβ-catenin/BMSC细胞中β-catenin蛋白表达水平明显降低,siβ-catenin明显抑制ALP和MBP-2的蛋白表达;HLY78明显激活β-catenin蛋白表达,SIM联合HLY78作用重新激活ALP和MBP-2的蛋白表达。茜素红染色结果显示,siβ-catenin/BMSC细胞中茜素红染色阳性矿化钙结节面积显著减少(P<0.05);siβ-catenin细胞的茜素红染色阳性矿化钙面积、ALP活性、ALP和BMP-2浓度显著低于siNC细胞(P<0.05);而SIM联合HLY78作用重新激活ALP活性、ALP和MBP-2的蛋白表达,恢复茜素红阳性染色;DDK1处理的细胞矿化钙结节面积、ALP活性、ALP和BMP-2蛋白表达显著降低,而HLY78联合SIM处理显著增加矿化钙结节面积、重新激活ALP活性以及促进成骨分化相关蛋白的表达。结论及意义:1.低浓度辛伐他汀(0.3 nmol/L)能诱导BMSC细胞向成骨细胞分化,促进骨分化相关基因的mRNA和蛋白表达,增强ALP活性,增加ALP和茜素红染色,诱导BMSC细胞分泌ALP和BMP-2。2.shRNA介导β-catenin低表达或Wnt/β-catenin通路抑制剂DDK1能抑制BMSC细胞的成骨分化,靶向Wnt/β-catenin通路激动剂HLY78则促进BMSC细胞的成骨分化。3.辛伐他汀可能与β-catenin转录起始位点结合增强β-catenin启动子活性,促进β-catenin表达和核转运。4.Wnt/β-catenin信号通路是辛伐他汀诱导BMSC细胞成骨分化所必需,辛伐他汀通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进BMSC细胞成骨分化。5.辛伐他汀诱导BMSC细胞成骨分化的分子机制至少部分依赖Wnt/β-catenin信号通路(可能与AKT信号通路激活有关),而不依赖JNK通路。