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目的制备表达免疫优势抗原Ag85A的DNA疫苗,以其加强卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)初免的作用,并评价其抗结核(Tuberculosis, TB)的作用；同时分析疫苗接种后诱导的T细胞应答,并探讨其与免疫保护的关系。方法以真核表达载体pVAXI重组表达分枝杆菌抗原Ag85A,制备不含内毒素的DNA疫苗Ag85A DNA。分别以PBS、BCG、BCG-Ag85A DNA(BCG初免-Ag85A DNA加强)、Ag85A DNA免疫小鼠,在免疫后8周进行结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)攻击感染。感染后第1周和第5周,分别计数感染小鼠脾和肺内的荷菌量,同时分析其肺和脾组织匀浆中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-12、IL-4、IL-6、IL-10和TGF-β等细胞因子的表达,并对第5周小鼠的脾和肺进行病理学检查和免疫组化分析,以评价该免疫策略对小鼠的抗结核保护作用。免疫后第8周,分别制备小鼠的肺和脾单细胞悬液,ELISPOT分析抗原特异的IFN-γ的分泌,流式细胞术分析T淋巴细胞Mtb特异的IFN-γ、TNF-α和IL-2的分泌及其CD44、CCR7、CD62L的表达,以评价该免疫策略的免疫原性并分析其与免疫保护效果之间的关联性。结果Ag85A基因成功插入pVAXI质粒,测序结果与GenBank公布的完全一致。免疫小鼠攻击后第1周,肺CFU(colony forming unit,菌落形成单位)计数各组问没有显著差异,脾内尚不能检测到Mtb的存在；攻击后第5周,BCG-Ag85A DNA组脾和肺内的CFU均最低,BCG组与PBS组相比亦有显著的下降,但Ag85A DNA组与PBS组、BCG组相比均无显著的统计学差异。病理学检查BCG-Ag85A DNA组的病理损害也最轻。感染后第1周细胞因子的表达肺和脾几乎都没有统计学差异,第5周IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-10、TGF-β均为Ag85A DNA组最高,BCG组次之,BCG-Ag85ADNA组最低,PBS组与BCG-Ag85A DNA组相差不大,其他因子组间差异较小。免疫后第8周(未感染)的小鼠CD4T细胞反应的评价发现：PPD特异的IFN-y分泌细胞BCG组和BCG-Ag85A DNA组比PBS和Ag85A DNA多,但两者间无明显差异；Ag85A特异的IFN-y分泌细胞BCG-Ag85A DNA组则仅比PBS组高。流式细胞术分析单个细胞水平的IFN-γ、TNF-α及IL-2的表达,BCG-Ag85A DNA免疫小鼠能产生较高频率的IL-2+、IL-2+TNF-α+、IFN-y+IL-2+以及IFN-y+TNF-a+IL-2+多功能CD4T细胞(p<0.05)；BCG免疫诱导出更多的IFN-y+和IFN-γ+TNF-a+CD4T细胞；而Ag85ADNA单独免疫诱导的Thl型CD4T细胞反应则较低。分析这些细胞的校正平均荧光强度值(intergrated mean fluorescence intensities, iMFI)发现BCG-Ag85A DNA组IL-2的iMFI值最高。所有的细胞因子分泌细胞均为CD44high; TNF-a分泌细胞几乎都为CD62Lhigh, IFN-γ和IL-2分泌细胞的CD62L表达则有高有低,除了少量TNF-a分泌细胞外所有的细胞因子分泌细胞均为CCR7low。此外,BCG-Ag85A DNA组诱导的CD8T细胞反应也较强。结论BCG初免-Ag85A DNA加强免疫策略可以显著提供小鼠较BCG强的保护作用,表现为CFU下降病理损害减轻；同时可诱导出更强的CD4和CD8T细胞反应,IFN-y+TNF-a+IL-2+多功能CD4T细胞、IL-2分泌细胞及其分泌量均增加,因此能提供更好的保护；虽然Ag85A DNA加强可以诱导出更多的多功能T细胞和IL-2的分泌,但不能弥补BCG诱导TcM不足的缺陷。