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研究背景及目的:肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,最常见的类型为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。HCC是我国癌症死亡的常见原因之一,对国家医疗保健造成了巨大的经济负担。HCC发病隐匿,多数患者在疾病中晚期才确诊,通常错过了治疗的最佳时期。近年来,尽管已在肝癌的诊疗方面取得进展,但由于肝癌发病机制复杂,尚缺乏有效的治疗靶点与分子靶向药物,导致疾病死亡率居高不下。因此,寻找新的治疗药物对于肝癌的治疗具有重要意义。白藜芦醇属于天然多酚类化合物,因具有多种抗肿瘤生物学活性而被视为极具肝癌治疗前景的药物。大量研究发现,白藜芦醇具有抑制肿瘤细胞增殖、转移、诱导细胞凋亡等多种生物学作用。白藜芦醇通过调节p53、SIRT1等多种肿瘤相关基因的表达调节肝癌的进展。然而,其具体机制尚未研究清楚。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3,GPC3)属于硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族的一员,在细胞信号传导中具有重要的功能。GPC3在正常成人组织中不表达,但在大部分肝癌组织中高表达。此外,肝癌患者预后与GPC3的表达水平有关。因此,GPC3有望成为新的生物标志物。研究显示,GPC3主要通过活化wnt/β-catenin信号通路参与肝癌的发生发展。此外,GPC3的表达与自噬底物p62存在一定的相关性,然而其具体机制尚未研究清楚。自噬是指细胞质、细胞器、蛋白质等被包裹入自噬体的双膜囊泡中,然后将自噬体靶向运送到溶酶体进行降解的过程。自噬功能失调与很多疾病有关,包括神经退行性疾病、代谢性疾病和肿瘤等。研究发现,在肝细胞中自噬功能失调可导致细胞的恶性转化和肿瘤的发生。在肝癌组织中的研究也发现,其基础自噬水平明显低于正常细胞。多种蛋白和RNA可调控自噬,包括自噬相关基因、lnc RNAs等。有研究报道,GPC3与自噬底物p62的表达有相关性,且白藜芦醇也可诱导肝癌细胞自噬。然而GPC3是否参与了白藜芦醇对HCC的调节尚未有研究报道。因此,本研究旨在探讨GPC3与自噬在白藜芦醇抗HCC的调节作用及机制,为进一步明确白藜芦醇抗肝癌机制提供新的理论依据。方法:采用不同浓度白藜芦醇(0、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)处理huh7细胞24h后,MTT检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测GPC3、β-catenin、cyclin D1、c-myc、PARP、caspase3、cleaved-caspase3的表达,免疫荧光技术检测GPC3的表达。采用80μmol/L白藜芦醇单独或联合GPC3质粒处理huh7细胞24h后,MTT检测细胞存活率,Western blot检测PARP、caspase3、cleaved-caspase3的表达。采用不同浓度白藜芦醇刺激huh7细胞,western blot检测自噬标记蛋白Beclin1、LC3、p62的表达;huh7细胞转染m Cherry-GFPLC3质粒后再加80μmol/L白藜芦醇孵育24h,激光共聚焦显微镜观察自噬流的变化;分别采用GPC3质粒以及靶向GPC3的si RNA转染huh7细胞24h后,Western blot检测Beclin1、LC3、p62、β-catenin、cyclin D1、c-myc的表达;采用靶向β-catenin的si RNA或wnt/β-catenin通路抑制剂XAV-939处理huh7细胞24h后,Western blot检测Beclin1、p62、LC3的表达;采用m Cherry-GFP-LC3质粒以及靶向GPC3或β-catenin的si RNA共转染huh7细胞24h后,激光共聚焦显微镜观察自噬流的变化;采用GPC3质粒单独或联合wnt/β-catenin通路抑制剂XAV-939作用于huh7细胞24h后,Western blot检测Beclin1、p62、LC3的表达。结果:(1)白藜芦醇可以抑制huh7细胞增殖,诱导细胞凋亡,且呈剂量依赖性(p<0.05)。(2)白藜芦醇可以显著下调GPC3的表达水平,且呈剂量依赖性(p<0.05)。(3)白藜芦醇可以显著下调wnt/β-catenin通路靶蛋白β-catenin、c-myc、cyclin D1的表达水平,且呈剂量依赖性(p<0.05)。(4)过表达GPC3可以逆转白藜芦醇诱导的细胞增殖抑制和凋亡作用(p<0.05)。(5)白藜芦醇可以诱导自噬相关蛋白p62、Beclin1、LC3-II的表达上调,且增强细胞自噬流(p<0.05)。(6)过表达GPC3可下调huh7细胞p62、Beclin1、LC3-II的表达(p<0.05)。(7)干扰GPC3可上调huh7细胞p62、Beclin1、LC3-II的表达,增强细胞内自噬流(p<0.05)。(8)干扰β-catenin可上调huh7细胞p62、Beclin1、LC3-II的表达,增加细胞内自噬流(p<0.05)。(9)XAV-939抑制huh7细胞wnt/β-catenin通路后,p62、Beclin1、LC3-II的表达上调(p<0.05)。(10)与单独转染GPC3组相比,XAV-939联合GPC3质粒作用组的p62、Beclin1、LC3-II的表达上调(p<0.05)。结论:白藜芦醇可以通过下调GPC3/wnt/β-catenin通路诱导肝癌细胞自噬,从而发挥其抗肝癌作用。