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基于转座子随机插入建立突变子文库的方法,筛选得到6株突变株(命名为MsiA-MsiF)可被甘草种子浸提物诱导表达.通过Arbitrary PCR及亚克隆的方法得到转座子插入基因的两端序列,确定突变株中被失活的基因所编码的蛋白分别与LysE家族外运蛋白(msiA)、跨膜运输蛋白、跨膜蛋白、芳基硫酸酯酶、双组份转录调节蛋白及未知功能蛋白同源。其中与LysE蛋白同源的MsiA突变株被种子浸提物诱导的能力最强,而且,LysE家族在根瘤菌中报道很少,所以选择MsiA继续深入研究。
通过同源比对,我们在根瘤菌的4个属中均发现了LysE家族蛋白。我们将同源性最高的3个基因进行了克隆和融合报告基因lacZ检测表达.结果发现:这3个基因都能被CAN诱导表达。突变后对种子浸提物中的CAN的处理均很敏感,这些证据表明LysE家族蛋白广泛存在于根瘤菌中,它们的功能一致:均与刀豆氨酸或氨基酸的运输有关。
在无氮源的基本培养基中,刀豆氨酸对msiA和msiA缺失突变株的毒性要比野生型高近一万倍。蔡韬等用mcherry报告基因构建刀豆氨酸的简易检测菌株,同时在msiA缺失菌株中构建检测刀豆氨酸的高效检测菌株检测刀豆氨酸的浓度,用高效检测菌株检测刀豆氨酸在野生型及msiA缺失菌株细胞中的刀豆氨酸含量,发现msiA缺失突变株对刀豆氨酸超级敏感,原因是MsiA蛋白的缺失使得细胞内聚集大量的刀豆氨酸,这说明MsiA蛋白为刀豆氨酸外运蛋白。
蔡韬等通过实验证明msiA突变株在甘草植株根毛上的吸附量要比野生型低100倍,可能是由于MsiA蛋白的缺失,不能将甘草分泌的刀豆氨酸有效的运出胞外而被刀豆氨酸杀死所致.
从甘草根部取得根际土,分离细菌并对其刀豆氨酸的耐受性进行检测,发现甘草根际土壤菌群中耐受刀豆氨酸与刀豆氨酸敏感菌株的比值比对照土样中的高八倍。这说明,甘草分泌的刀豆氨酸对其根际菌群具有一定的正向筛选作用.
根据上述试验数据提出根瘤菌的LysE系统和其宿主植物分泌物中刀豆氨酸的互作模型:在豆科植物生长初期,种子和植株分泌的刀豆氨酸可能杀死植株周围潜在的有害细菌,对根际菌群进行一次初步筛选,而在对宿主生长有益的根瘤菌中,存在LysE系统可以将对细菌有毒性的刀豆氨酸运出细胞,使得根瘤菌可以在甘草根际成为优势菌种.这可能是根瘤菌与宿主植物在长期的进化过程中相互选择适应的结果。