系统性白念珠菌感染快速检测的实验研究

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目的:据报道[1,2,3],由于广谱抗生素、皮质类固醇激素、免疫抑制剂和细胞毒抗恶性肿瘤药物在临床上的广泛应用,以及器官移植,导管插管和放疗、化疗的开展,尤其免疫抑制或免疫缺陷的患者在不断地增加,导致了系统性真菌的感染率逐年上升,白念珠菌是最常见的致病菌株。早期、快速诊断系统性白念珠菌感染,能够有效的指导临床用药,抓住治疗时机,为整个疾病的好转及减少病死率提供重要保证。本实验建立系统性白念珠菌感染动物模型,并筛选出McAb03.2C1-C2最佳稀释浓度,建立系统性白念珠菌感染快速检测系统,探讨其特异度(specificity)和敏感度(sensitivity),初步检测系统性白念珠菌感染病人的血清标本。  方法:经新西兰大耳白兔耳缘静脉注射1.5ml,浓度为5X107cells/ml(半数致死量)白念珠菌菌液,于注射后12h、24h、48h、72 h、1w、2w分别采集兔血,2w后处死动物,无菌操作取肾脏、肝脏组织行PAS染色,建立系统性白念珠菌感染动物模型;采用方阵滴定ELISA法,DTT法提取带芽管白念珠菌孢壁外膜(倍比稀释0.625-40μg/ml)为包被抗原,McAb03.2C1-C2(倍比稀释1:250-1:128000)为Ⅰ抗,辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG为Ⅱ抗,筛选出McAb03.2C1-C2最佳稀释浓度和抗原的包被浓度;用McAb03.2C1-C2最佳稀释浓度作为包被抗体,HRP- McAb03.2C1-C21:5000作为检测抗体,采用双抗体酶联免疫法检测动物模型和系统性白念珠菌感染病人的血清标本,用SPSS13.0统计学软件处理数据,计算A值,探讨其特异度和敏感度。  结果:兔血培养检测阳性结果和肾脏组织病理学检测 PAS染色见紫红色孢子、菌丝和大量的中性粒细胞,证明动物模型建立成功;间接ELISA实验筛选出抗原包被浓度为1.25μg/ml-40μg/ml和McAb03.2C1-C2稀释度为1:4000-1:8000时有较好的线性关系,McAb03.2C1-C2稀释度1:4000可作为双抗体酶联免疫实验的包被抗体;检测动物模型血清标本的特异度和敏感度分别为95.2%、92.3%,在白念珠菌感染12小时就能检测出白念珠菌芽管上抗原,随着感染时间的延长,测的A值数值逐渐降低,呈现抗原浓度在血中含量有逐渐减少的变化;5例患者血标本A值平均值分别为0.102、0.109、0.121、0.100、0.117,5例P/N值≥2.1,检测为阳性,ELISA检测病人血清标本与血培养结果相一致。  结论:通过本次实验,成功的建立了系统性白念珠菌感染快速检测系统,并在动物实验上验证该检测系统有较好的敏感性和特异性,初步鉴定系统性白念珠菌感染病人的血标本,与现阶段血培养结果相一致,但在时间和操作上更优于血培养。本实验为早期、快速检测系统性白念珠菌感染建立一个较好的血清学诊断方法。
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