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植物次生代谢物质对昆虫行为的调节作用是当前国际研究的热点，为创制“昆虫行为调节剂”等新型生物农药提供了新思路与途径。本研究基于成功获得闹羊花素Ⅲ产卵忌避靶标蛋白-化学感受蛋白1（chemosensory protein，PxylCSP1）的基础之上，继续深入研究小菜蛾(Plutella xylostella(L.))产卵忌避相关化学感受蛋白及其互作蛋白在昆虫体内信息传递的分子机制。首先构建了PxylCSP1昆虫细胞杆状病毒表达系统；应用T7噬菌体展示技术进行了PxylCSP1互作蛋白的筛选；克隆了PxylCSP1互作蛋白-小菜蛾蛋白激酶C1(protein kinase C1，PxylPKC1)，应用Real-time PCR技术明确了小菜蛾PxylPKC1时空表达特征；构建了PxylPKC1原核表达载体，利用GSTpull-down技术，证明PxylPKC1蛋白与PxylCSP1之间在体外存在着相互结合作用。本研究主要结果如下：
(1)构建了PxylCSP1昆虫细胞杆状病毒表达系统，并获得高纯度重组蛋白。将PxylCSP1蛋白的成熟肽序列插入pIEx/BacTM-5，构建了N端融合的pIEx/Bac-CSP1重组转移载体；利用Insect GeneJuice转染试剂将供体载体pIEx/Bac-5-CSP1、BacMagic-2 DNA共转染进入Sf9细胞。同源重组后获得重组杆状病毒BacMagic-CSP1。利用GST-Bind树脂亲和的纯化方法，得到较纯的GST-PxylCSP1重组蛋白；用凝血酶切除融合蛋白的GST标签，获得的PxylCSP1的浓度为53.8μg/mL。
(2)构建了小菜蛾头部cDNA的T7噬菌体展示文库，初始文库的滴度为3.84×106 pfu/mL，符合cDNA初始文库的要求；对初始文库放大后，得到放大文库滴度为3.77×109 pfu/mL。以纯化获得的PxylCSP1为诱饵蛋白，对噬菌体展示文库进行4轮淘筛。随机挑取58个噬菌体单克隆，以T7 Select UP Primers及T7 SelectDOWN Primers为引物进行PCR验证，进一步用T7抗体对58个克隆进行ELISA检测，结果表明有19个为阳性克隆。对19个阳性克隆送样测序，并进行Blast序列比对分析，阳性克隆分别为蛋白激酶C，Take Out蛋白、气味结合蛋白、细胞色素氧化酶亚基Ⅲ、NADH脱氢酶亚基Ⅰ和一些尚未公布的新基因。这些阳性克隆的获得，为进一步研究PxylCSP1的信号传导机制奠定了基础。
(3)根据Genbank中登陆的昆虫蛋白激酶C氨基酸序列，设计兼并引物，采用RACE技术，以小菜蛾cDNA为模板，成功克隆得到小菜蛾蛋白激酶C基因的全长序列，命名为PxylPKC1。该基因编码框为2019bp，编码672个氨基酸，基因Genbank登录号为HQ620620，氨基酸序列登陆号为ADU04569。来自昆虫的19个PKC蛋白序列一致性分析表明，与PxylPKC1相似性最高的是云杉卷叶蛾(Choristoneurafumiferana)的蛋白激酶C1（CfPCK1，Genbank: ABZ88709），相似性为91.3％；相似性最低的是来自丝虫目的马来布鲁线虫(Brugia malayi)的XP_001897666，相似性为57.0%。
(4)采用Real-time PCR的方法对PxylPKC1在小菜蛾不同发育时期、不同组织中的时空表达特征进行分析。结果表明，PxylPKC1在雄虫腹部的相对表达量最高，在雌虫除去触角的头部相对表达量最高;PxylPKC1在雄虫除去触角的头部相对表达量最低；在整个发育期，3龄幼虫的PxylPKC1相对表达量最低，雄性蛹的相对表达量达到最高；交配后24h雄性小菜蛾的PxylPKC1相对表达量最高，交配后48h雌雄成虫比刚羽化雌雄虫PxylPKC1相对表达量均较低。
(5) PxylPKC1融合蛋白的构建、表达及与PxylCSP1互作的初步研究：成功构建了N端融合的pGEX-4T-3-PxylPKC1表达载体，采取IPTG诱导的方法在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，SDS-PAGE分析表明蛋白分子量约为100kDa，以可溶性及包涵体两种形式存在；用Glutathione Sepharose4B的方法，获得了较纯的GST-PxylPKC1融合蛋白；利用GST pull-down技术，证明PxylPKC1蛋白与PxylCSP1之间在体外存在着相互结合作用，为进一步的信号传导途径研究奠定了基础。
在系统研究的基础上，本研究初步阐述了CSPs介导的闹羊花素产卵忌避作用的分子机制，展望了昆虫化学感受通路中药物靶标蛋白在新型生物农药中的广泛应用前景。