B、T淋巴细胞弱化因子(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)是2003年发现的CD28家族共抑制受体，主要表达于T、B细胞，在DC、单核细胞及NK细胞上也有表达，能负性调节T、B细胞的激活与增殖，维持树突状细胞在内环境中的稳定，抑制记忆性CD8+T细胞的分化，其在肿瘤患者体内T细胞上高表达，提示在肿瘤的发生发展中发挥作用。为了进一步研究BTLA在肿瘤发生、发展中的作用，我们拟构建人BTLA(hBTLA)原核表达载体和表达蛋白并制备多克隆抗体，通过免疫组化法检测肺癌和结直肠癌组织中BTLA蛋白的表达，并分析其在肿瘤的发生、发展和侵袭转移中的作用。　　 [目的]　　 构建BTLA原核表达载体，诱导表达hBTLA融合蛋白，并经亲和层析法纯化，将其作为抗原免疫家兔，制备兔抗hBTLA多克隆抗体，纯化抗体后，在蛋白水平检测该分子在肺癌和结直肠癌中的表达情况，并分析BTLA基因在肿瘤的发生、发展中的作用。　　 [方法]　　 1.构建含hBTLA胞外区目的基因的T载体克隆及原核细胞表达载体亚克隆，并经酶切、PCR和测序证实。IPFG诱导表达hBTLA融合蛋白，SDS-PAGE电泳鉴定，将重组基因工程菌扩大诱导表达，亲和层析法纯化诱导的蛋白。　　 2.将纯化的蛋白与弗氏完全佐剂乳化，将其作为抗原免疫家兔，获得兔抗人免疫血清，经硫酸铵盐析纯化，获得初步纯化的兔抗hBTLA多克隆抗体，通过双扩散试验和间接ELISA法检测多克隆抗体效价和纯度，western blot及免疫组化方法初步鉴定其活性。　　 3.收集手术切除的肺癌和结直肠癌组织标本，应用免疫组织化学方法检测BTLA蛋白在肿瘤细胞中的表达情况，并分析其在肿瘤发生、发展中的作用。　　 4.用商品多抗和自制多抗建立ELISA夹心法，并对方法进行条件优化，测定其准确度、精密度、重复性和线性范围，方法建立后可用于检测血清中可溶性BTLA的含量。　　 [结果]　　 1.获得hBTLA胞外区重组基因工程菌的克隆，并表达具有抗原性的BTLA融合蛋白。　　 2.获得纯化的hBTLA融合蛋白，并用其免疫家兔，得到兔抗hBTLA多克隆抗体。以重组蛋白为抗原，用间接ELISA检测抗hBTLA抗血清的效价达到1:20000。双向琼脂免疫扩散试验显示抗hBTLA多克隆抗体与抗原之间形成单一沉淀线，效价达到1:16，表明所制备的多抗效价较高，并具有良好的纯度。　　 3.免疫印迹分析抗hBTLA抗血清在分子量约15.72KDa处与相应的原核表达蛋白呈现特异性结合条带，表明所制备的多克隆抗体具有较好的免疫学活性。免疫组织化学染色证明抗体能与肿瘤组织中天然表达的hBTLA蛋白特异性结合，与商品单抗检测结果一致。　　 4.22例肺癌标本和19例结直肠癌标本的免疫组化检测中，BTLA表达的阳性率分别为32％和100％，表达部位位于胞浆和胞膜区，在肺癌和结直肠癌组织中均有表达，但结直肠癌组织中的表达明显强于肺癌组织中的表达。　　 [结论]　　 成功构建了高效表达重组hBTLA蛋白的原核表达载体，获得高效稳定的重组基因工程大肠杆菌表达菌株，经诱导表达的hBTLA融合蛋白具有免疫原性，将其作为免疫原制备的兔抗hBTLA多克隆抗体能与纯化的外源性hBTLA融合蛋白和天然表达的内源性BTLA蛋白发生结合反应，检测抗hBTLA多克隆抗体效价、纯度、活性均达到预期要求。检测BTLA在蛋白质水平表达发现，BTLA在肺癌和结直肠癌组织中均有表达，但结直肠癌组织中的表达明显强于肺癌组织中的表达。BTLA可能参与肿瘤的发生、发展过程。