牙周病是人类发病率最高的疾病之一，其中牙龈炎和牙周炎是牙周病的两个主要组成部分。统计资料表明，国内外牙龈炎的发病率达70～90％，牙周炎的发病率达25～40％，是成人失牙的主要原因。 已证实各种心理和社会心理的压力可影响牙周病的严重程度和疾病进程(Freeman & Goss 1993，Linden等1996)，提示神经肽的局部释放可能提供对炎症变化的神经调节(Bartold等，1994)。P物质(Substance P,SP)在大部分口腔组织尤其在牙髓及牙周组织中含量较高，其具有的神经递质及神经调质作用使其成为组织炎症的重要标志物，Kvinnsland更认为牙周组织中SP水平是患者防御修复机制的重要参数，但其确切意义并没有完全阐明。因此，研究SP在牙周炎症组织中的表达和意义对指导牙周的全身性治疗有着极其重要的意义。 本研究采用组织块法体外培养人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast,HGF)，进行形态学、免疫组化染色(ABC法)的细胞鉴定；激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)检测加入SP后HGF胞内游离钙浓度的变化情况，分析SP在牙周炎症进程中的作用；采用放射免疫分析法测定牙周健康者和牙周炎患者磨牙区龈沟液(gingival crevicular fluid,GCF)间SP含量的差异，进一步分析SP含量与牙周炎组织破坏程度间的关系。 一、组织块法体外培养人牙龈成纤维细胞 [材料和方法]随机选择南京医科大学附属口腔医学院外科门诊就诊因正畸或阻生需要拔牙的患者，在志愿者完全知情同意下，对拔牙创以最小的创伤取少量牙龈组织。将取得的牙龈组织在无菌条件下剪成 南京医科大学硕士学位论文lmm x lmm x lmm大小，置于培养瓶，加入适量含10%胎牛血清的RPMI 1 640培养液，于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。0.25%胰酶消化法进行传代，细胞传代至第3代，行细胞爬片。采用免疫组化染色(IHC)进行细胞鉴定，以确认培养的细胞为人牙跟成纤维细胞。【结果】免疫组化染色(ABC法)结果显示，人牙跟成纤维细胞表达波纹丝蛋白而不表达角蛋白。 二、p物质对牙娘成纤维细胞胞内游离钙浓度的影响I材料和方法l取前法培养的人牙跟成纤维细胞，继续培养至第4代，经胰酶消化法消化细胞，调节细胞浓度为105/L，接种于六孔板，每孔底预置一片24~x24~盖玻片，继续培养24h，待测。避光条件下加入荧光探针Fluo一3/AM标记细胞，置于激光扫描共聚焦显微镜载物台上。加sP药液到盖玻片，使细胞外最终药液浓度为10一7mol/L，选择贴壁良好的活细胞进行观察。采用激光扫描共聚焦显微镜对细胞加入SP前后进行动态扫描，激发波长488nm，发射波长520nm。对扫描得到的荧光图像进行分析，得到反映细胞内游离钙浓度在SP刺激下动态变化的曲线。l结果l细胞刺激前荧光值稳定，加入10一7mol/L浓度的SP后发生明显变化，荧光值平均增加约80%。 三、牙周健康者及牙周病患者眼沟液中SP的检测及意义【材料和方法】随机选择南京医科大学附属口腔医学院牙周科门诊中等程度的成人牙周炎患者巧例。在患者口内各选一个健康、牙跟炎、牙周炎牙位收集GCF样本。对照组健康个体巧例，临床无牙跟及牙周炎症。用不同体积的血清浸润20xZmm的滤纸条，得到滤纸浸润长度与GCF体积之间的标准回归方程。用洁治器小心去除待取样本区域跟上菌斑、牙石，将滤纸条轻插入跟沟内，30秒后取出，测量浸润面积，得到GcF体积。将该滤纸条放入450曰pH7.2的冷冻0.olM磷酸钠缓冲液中，内含0.巧M氯化钠，震荡30秒，存于一80℃冰箱待用。GCF样本加入放射性标记物’2，I一SP进行放射免疫分析，沉淀部分采用南京医科大学硕士学位论文Y计数仪进行计数。所有样本采用复管分析。所测得结果的处理采用单因素方差分析。【结果】牙周炎患者GCF中SP含量(30秒钟总量)与牙周组织的破坏程度明显相关。牙周炎组个体的健康牙位、牙跟炎牙位和牙周炎牙位SP含量有升高趋势，且其总含量随炎症程度的加重而增高，结果有显著性差异(P<0.001)。牙周炎组健康牙位GCF中SP总量较对照组为高。统计分析，SP总量与PD、AL呈显著性相关(P<0.05)。 结论 在有胞外钙离子存在的条件下，加入一定浓度的SP后，可引起人牙跟成纤维细胞中细胞内游离CaZ‘的一过性升高。提示在炎症状况下，组织中SP的存在，可以对人牙银成纤维细胞起作用，引起人牙跟成纤维细胞中细胞内游离CaZ‘浓度的升高，进而引发一系列的生理反应。提示在牙周病早期，GCF中的SP即有可能对GF产生作用。此外，在牙周病的炎症早期，SP的释放量就相当高，且牙周病患者的GCF中SP含量较牙周健康者高，尤其在病变部位的GCF中，SP含量更高，同时，SP总量与PD及AL显著相关，提示SP与牙周炎破坏程度密切相关，可以作为牙周炎临床检测的重要指标。