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泥蚶(Tegillarca granosa)是我国主要的养殖经济贝类之一,具有很高的经济价值。然而,随着工业废水排放量的迅速增加,泥蚶的养殖环境逐渐恶化。再加上累代人工养殖后,造成了泥蚶种质退化,抗逆能力下降,由外界病原或者各种压力产生的疾病频繁地发生在泥蚶的群体中,造成了经济损失、食品安全等方面的问题。因此,对泥蚶功能基因尤其是抗逆相关基因的作用机制进行深入研究,对泥蚶养殖业的可持续发展具有重要的意义。 泥蚶在受到外界病原或者各种压力胁迫刺激时,会发生呼吸爆发的现象,产生大量的活性氧来消除外来的病原体。活性氧可以杀灭外来的病原,也可以在生物体内发挥积极的生物学作用。但是,过量的活性氧会对机体的核酸、蛋白、生物膜等产生伤害,致使细胞凋亡,因此及时地清除机体内过量的活性氧可以提高机体对外界病原体的抵抗力和免疫力。 抗氧化酶可以清除活性氧,是维持机体内氧环境平衡,抵抗外界环境影响的重要因子。本研究采用同源克隆和RACE技术克隆了泥蚶抗氧化酶中的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的cDNA全长,并对这三个基因的结构进行生物信息学分析。 1、泥蚶GPx基因(TgGPx) cDNA全长为1195bp,包含45bp5-UTR,639bp开放阅读框(ORF)和511bp3-UTR。ORF编码212个氨基酸残基,预测蛋白分子量为24.3kDa,理论等电点为8.33,其中,第53个氨基酸U是由密码子UGA编码的硒代半胱氨酸(Se-Cys)。在3-UTR上存在一段序列,形成一种独特的茎环结构,即SECIS元件。SECIS元件在密码子UGA翻译为Se-Cys的过程中起决定性作用。TgGPx基因序列中存在GPx家族签名序列LGFPCNQF和活性位点序列WNFEKF和保守的活性氨基酸。通过序列比对与系统进化分析,发现TgGPx与紫贻贝和三角帆蚌的相似度最高,与其他物种也具有较高的相似度。还发现在软体动物中也存在不同种类的GPx基因,TgGPx与GPx1和GPx2的亲缘关系较近; 2、泥蚶CAT基因(TgCAT) cDNA全长为2017bp,包含73bp5-UTR,1521bp开放阅读框(ORF)和423bp3-UTR,编码506个氨基酸,预测蛋白分子量为57.4kDa,理论等电点为8.62。在TgCAT基因的氨基酸序列中存在近端活性位点FnReripERvvHakGAG和近端血红素配体签名序列RLFSYpDTH、两个糖基化位点NFSQ和NWSK以及与功能相关的保守氨基酸,通过序列比对与系统进化分析,发现TgCAT基因与合浦珠母贝、近江牡蛎等软体动物的同源性最高,与其他物种也有较高的同源性,从NJ进化树可以看出CAT基因基本遵循物种的进化规律; 3、泥蚶SOD基因(TgSOD) cDNA全长为696bp,包含46bp5-UTR,465bp开放阅读框(ORF)和185bp3-UTR。ORF编码154个氨基酸残基,预测蛋白分子量为15.86 kDa,理论等电点为6.16。TgSOD氨基酸序列中存在铜锌超氧化物歧化酶蛋白家族签名序列GFHIHEFGDNT和GHAGGRLACGVI和铜锌结合位点(Cu分别与His47,His49,His64,His121配位,Zn则与His64,His72,His81,Asp84配位)。通过序列比对与系统进化分析,发现TgSOD基因氨基酸序列与智利贻贝、近江牡蛎等软体动物的同源性最高,与其他物种序列也具有较高的相似性,从NJ进化树可以看出Cu/Zn SOD基因并不严格遵循物种的进化规律。 4、利用实时定量PCR技术对泥蚶谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶基因不同组织的表达情况以及在重金属胁迫下的表达量变化情况进行分析,结果表明,TgGPx和TgCAT在泥蚶的5个组织中都有表达,但存在组织特异性。TgGPx基因在外套膜中的表达量最高,在血细胞中的表达量最低;TgCAT基因在鳃中表达量最高,在血细胞中表达量最低。用重金属pb2+、Cu2+、Cd2+刺激后,TgGPx基因在pb2+处理组的表达量逐渐升高,在12h的表达量最高;在Cu2+处理组和Cd2+处理组中TgGPx基因表达量的变化趋势比较相似,为升高-降低-升高-降低,Cu2+处理组和Cd2+处理组的表达量均在24h达到最大值。TgCAT基因在经过重金属刺激后,在pb2+处理组和Cu2+处理组,表达量先降低然后升高。TgCAT在pb2+处理组的表达量在24h达到最高,在Cu2+处理组的表达量在48h达到最高;在Cd2+处理组,TgCAT基因的表达量的变化趋势为升高-降低-升高-降低,在24h表达量达到最大值。总之,TgGPx和TgCAT在肝胰脏中的表达量均有显著升高,表明TgGPx和TgCAT在维护机体正常功能方面及泥蚶抵御外界刺激的应激反应中发挥作用。