构建新型电化学生物传感器并应用于细菌相关靶标检测

来源 :温州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:MYUCHUAN
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目的:  (1)利用四面体DNA纳米结构电化学基因传感器对多种细菌进行快速灵敏的通用及特异性检测。  (2)构造一种新的光学和电化学方法,检测生物小分子ATP。  方法:  (1)提取细菌RNA,使用具有特异性或通用性的引物对cDNA进行扩增,构造四面体DNA电化学基因传感器,利用特异性或通用探针对扩增产物进行检测。  (2)在葡萄糖氧化酶法葡萄糖检测体系中,加入以三磷酸腺苷和葡萄糖为底物的己糖激酶与葡萄糖氧化酶竞争消耗葡萄糖,葡萄糖信号的变化间接反映了溶液中ATP的含量。通过光学法和电化学方法对ATP进行检测。  结果:  (1)基于16S rRNA的细菌检测实验:  首先,以E.coli为模型,对四面体DNA电化学基因传感器的检测灵敏度进行了考察,结果表明,对合成DNA的检测限可以达到100aM,对不对称PCR产物的检测限为10fM。随后,对9种细菌特异性扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳表征,结果表明,9种引物都能对其对应菌种实现扩增,而且对部分细菌达到了1CFU的检测水平;对9种细菌通用扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳表征,结果显示,9种细菌均有明显扩增产物。再者,考察了引物特异性,发现,在现有PCR条件下6种引物特异性不理想。最后,考察了四面体DNA电化学基因传感器对除E.coli外的其余8种细菌的合成DNA的检测灵敏度,结果表明,该体系对9种细菌的合成DNA均具有10fM的检测限。  (2)基于己糖激酶的ATP检测方法:第一,通过比较不同浓度ATP对TMB显色的抑制作用,直观上验证了该方法具有可行性。第二,通过优化葡萄糖检测体系提高体系对ATP的检测性能,光学方法对葡糖糖检测限为4μM,对ATP检测限为5μM。第三,设计并优化电化学检测体系,实现了10μM葡萄糖和ATP的快速检测。  结论:  通过联合不对称PCR技术和四面体DNA纳米结构电化学基因传感技术,成功实现了快速灵敏的细菌检测。构造了一种新的ATP检测方法并实现了对ATP的快速检测。
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