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Cajal间质细胞(ICCs)是胃肠道的起搏细胞,具有产生节律性慢波、传递电信号及调节慢波传递等功能。牵张应变是胃肠平滑肌在消化过程中常见的生理性或病理性刺激。蠕动的食物或食糜对胃肠的扩张作用直接对平滑肌细胞及ICCs产生牵拉刺激,从而改变胃肠蠕动功能。胃肠道平滑肌的牵张应变刺激一般引起被牵拉肌肉的收缩活动增强,发生这种改变的机制有两种,即神经源性机制和肌源性机制,目前神经源性机制已比较明确,但关于肌源性机制的研究尚存在需要进一步解决的科学问题。研究表明,肌源性机制与平滑肌细胞膜离子通道活动有关,如细胞膜被牵张变形可以激活某些离子通道。然而,ICCs作为胃肠运动调控中的热点细胞,其起搏功能与牵张应变之间的关系研究甚少。
为了明确牵张应变对ICCs起搏活动的影响及机制,我们采用膜片钳、细胞外记录以及钙荧光成像技术等手段,探讨了体外培养的小鼠小肠ICCs起搏电流特性、产生机制以及牵张应变对ICCs起搏电流的影响。
研究结果如下:
一、ICCs起搏电流的电生理学特性
1.胞内外钙离子的作用:采用膜片钳传统全细胞记录模式,发现胞外无钙灌流液使ICCs起搏电流消失；高浓度(10 mmol/L)EGTA使胞内钙离子浓度降低或采用单通道记录模式直接降低胞内钙离子浓度,ICCs起搏电流活动增强；FCCP(线粒体的解偶联剂)造成胞内钙离子浓度升高使ICCs起搏电流逐渐被抑制。
2.钙库的作用:IP3受体敏感钙库的阻断剂2-APB阻断起搏电流；Ryanodine受体敏感的钙库阻断剂Ryanodine不影响起搏电流；胞内钙库的钙泵抑制剂Thapsigargin阻断起搏电流。
3.起搏电流成分:用NMDG+(NMDG+不能通过离子通道)取代细胞外灌流液中的Na+离子,起搏电流消失；非选择性阳离子通道阻断剂Gd3+阻断ICCs起搏电流。
4.细胞骨架微丝的作用:Cytochalasin-B(微丝的解聚剂)显著抑制起搏电流和钙振荡的幅度和频率,但基础钙水平未受Cytochalasin-B影响；Phalloidin(微丝的稳定剂)显著增强起搏电流和钙振荡的幅度和频率,但基础钙水平未受Phalloidin影响；2-APB阻断Phalloidin对起搏电流和钙振荡的增强作用；而Ryanodine不能阻断Phalloidin对起搏电流和钙振荡的增强作用。
二、牵张应变对ICCs起搏功能的影响及其机制研究
1.在组织水平,利用细胞外记录方法记录了小肠的慢波和快波。牵拉小肠壁引起小肠慢波幅度、快波频率和幅度均显著增加,但小肠慢波频率不受影响。
2.在传统全细胞电压钳和电流钳模式下,低渗诱导的细胞膜牵张(Membrane stretch-induced by hyposmotic cell swelling,MSHC)激活一种持续的内向钳制电流,使ICCs静息电位发生去极化,并降低自发性起搏电位和电流的幅度,但对起搏电位和电流的频率无显著改变。
3.胞内外钙离子的作用:采用膜片钳传统全细胞记录模式,发现细胞外无钙灌流液阻断MSHC诱导的ICCs内向钳制电流；高浓度(10mmol/L)EGTA降低胞内钙离子浓度,对MSHC激活的ICCs内向钳制电流无影响；FCCP(线粒体的解偶联剂)造成胞内钙离子浓度升高,阻断MSHC激活的内向钳制电流。
4.钙荧光成像技术显示,MSHC显著增高ICCs胞内基础钙水平,并增加ICCs自发性钙振荡的幅度,但钙振荡频率未见显著改变。
5.钙库的作用:IP3受体敏感的钙库阻断剂2-APB对MSHC诱导的持续性内向钳制电流无阻断作用；Ryanodine受体敏感的钙库阻断剂Ryanodine和胞内钙库的钙泵抑制剂Thapsigargin完全阻断MSHC诱导的内向钳制电流。通过钙荧光成像实验得到相似结果,即Ryanodine阻断MSHC引起的胞内基础钙浓度增高的作用,而2-APB未能阻断MSHC对胞内基础钙浓度和钙振荡幅度的增强作用。
6.MSHC诱导的内向钳制电流成分:用NMDG+(NMDG+不能通过离子通道)来取代细胞外灌流液中的Na+离子,MSHC不能再诱导出内向钳制电流；非选择性阳离子通道阻断剂Gd3+抑制MSHC激活的内向钳制电流。
7.细胞骨架微丝的作用:Cytochalasin-B阻断MSHC激活的内向钳制电流和钙振荡增强作用,并阻断MSHC对基础钙水平增加的作用；Phalloidin(微丝的稳定剂)不阻断MSHC诱发的内向电流和钙振荡增强作用,且不能阻断MSHC对基础钙水平的增加作用。
以上结果提示:①ICCs起搏电流的产生与低钙敏感的非选择性阳离子通道开放有关,IP3受体敏感的钙库释放钙离子(IICR)是起搏电流产生的关键因素；②细胞骨架微丝参与ICCs起搏活动的调节,与IICR有关；③牵张应变引起平滑肌收缩增强的机制与慢波幅度增强有关；④牵张应变增强小肠ICCs起搏电活动,其机制与非选择性阳离子通道开放及Ryanodine受体敏感的钙库释放钙离子(CICR)有关；⑤细胞骨架微丝参与牵张应变增强小肠ICCs起搏活动的调节,其机制与微丝对胞内钙信号的调节有关。