辅酶Q10(Coenzyme Q10,简写为Co Q10),又称泛醌,化学名称为2,3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基-1,4-苯醌。广泛存在于酵母、植物叶子和种子及动物的心脏、肝脏和肾脏中,是细胞呼吸链上的一种递氢体,是细胞自身产生的天然抗氧化剂、细胞代谢激活剂,具有抗氧化性、消除自由基、提高机体免疫力、抗衰老等功能。广泛应用于各类心脏病、癌症、急慢性肝炎、帕金森症等疾病的治疗。本文对根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)发酵制备辅酶Q10的提取工艺和发酵条件进行了研究,以期为进一步扩大辅酶Q10生产规模提供基础理论和试验指导。主要研究内容和结果如下:(1)比较文献报道的三种辅酶Q10的测定方法,即紫外分光光度法、可见分光光度法和高效液相色谱法,确定高效液相色谱法测定辅酶Q10的最佳参数:色谱柱Hypersil ODS C18 (5μm,4.6mm×250mm,Germany);流动相为无水乙醇和甲醇(9:1,V:V);流速1.0mL/min;检测波长275nm;进样量10μL;柱温为室温。鉴于紫外分光光度法方法简便、成本低、准确度较高并且与高效液相色谱法具有一定相关性,提出在菌种选育和发酵条件优化研究中用紫外分光光度法代替高效液相色谱法定量测定辅酶Q10的方法。(2)考察研磨法、酸热法、反复冻融法和超声波破碎法对根癌土壤杆菌细胞破碎和辅酶Q10提取效果的影响,确定了每种破壁方法的最佳工艺条件,研究了辅酶Q10的皂化工艺、萃取条件,得到了辅酶Q10的最佳提取工艺:将收集的菌体按10mL/g的量添加3 mol/L盐酸,90℃破壁30min,迅速冷却,将获得的细胞碎片移入圆底烧瓶中,加入2.5倍(体积比)量的10%的氢氧化钾-甲醇溶液,60℃回流30min,迅速冷却,按40mL/g的料液比添加石油醚,萃取2次,静置分层,合并上清液用去离子水洗至中性,以无水硫酸钠脱水至澄清,用真空旋转蒸发仪(50℃)浓缩至干,挥发完后,加入无水乙醇10mL。放入冰箱冷冻,过滤,无水乙醇定容至50mL,待测。(3)以根癌土壤杆菌AT-01为出发菌株,经紫外线和硫酸二乙酯诱变处理,采用抗性筛选法,直接在平板上挑取抗辅酶Q10结构类似物维生素K3、呼吸链抑制剂NaN3的菌株进行初筛,然后经摇瓶发酵法进行复筛,获得一株生产性能比出发菌株显著提高的突变株AT-N10,其辅酶Q10产量为5.854mg/L,较出发菌株提高71.43%,每克干细胞含辅酶Q10 1.744mg,较出发菌株提高47.05%。菌株经5次传代培养,辅酶Q10产量下降2.61%。AT-N10是一株性状较稳定可深入开发研究的优良菌株。(4)应用Plackett-Burman试验设计和响应面分析方法对突变株AT-N10的培养条件进行了系统研究,得到了优化的培养基组成:葡萄糖34g/L,FeSO4·7H2O 9.8mg/L,酵母膏10.40g/L,PHB 44.3mg/L(培养24后加入),蛋白胨10g/L,K2HPO4 1.0g/L,KH2PO4 1.0g/L,MgSO4·7H2O 0.3g/L,MnSO4·H2O 50mg/L,ZnSO4·7H2O 10mg/L,生物素100μg/L,烟酸50mg/L,肌醇20mg/L。并通过单因素试验确定了最佳的发酵条件:接种量6%,初始pH值7.0,摇床转速180r/min,发酵温度28℃,装液量50mL/250mL,发酵时间96h。采用此优化工艺,辅酶Q10的产量达17.195mg/L,比优化前提高193.73%。(5)在优化的发酵培养基基础上建立了辅酶Q10产生菌摇瓶发酵动力学模型,试验中采用Logistic方程描述了菌体生长的动力学过程;采用Leudeking-Piret方程描述了产物合成的动力学过程;用Leudeking-Piret-Like方程描述了底物消耗的动力学过程。从试验结果可知,模型可以较好的解释实际发酵中细胞生长、底物利用和产物合成的动力学规律。