根据GenBank已公布的禽流感病毒H9亚型血凝素蛋白编码基因，设计了一对引物（H1和H2），RT-PCR扩增禽流感病毒A/Duck/Shanghai／02／99（H9）的HA基因，扩增片段与载体pUCm-T的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，重组质粒pUCm-T-HA经限制性内切酶酶切和PCR鉴定后进行测序。BlastN分析结果显示该分离株血凝素编码基因与已发表的鸭源禽流感病毒A/Duck／Shantou／1605／01（H9N2）和A／Duck／Hong Kong/Y280／97（H9N2）血凝素编码基因的核苷酸序列同源性为98％，从而从分子水平确定了该分离株为H9亚型禽流感病毒。 根据禽流感病毒M基因设计并筛选出两对引物M1和M2、M3和M4，以H1和H2、M3和M4建立了禽流感病毒的双重RT-PCR检测方法。检测80份临床样品，检出阳性样品17份，阴性样品63份，与鸡胚分离方法检出率相同且符合率为100％。同时该方法快速、简便，并且能在通过检测M基因确定是否为禽流感病毒的同时鉴定是否为H9亚型，从而为临床及实验室提供了一种快速、灵敏的检测AIV并鉴定其亚型的方法。 根据引物M3和M4扩增片断序列设计了探针M5，建立了快速检测A型流感病毒的荧光RT-PCR检测技术。该方法可检测到0.1EID₅₀，鸡胚分离可检测到1EID₅₀，说明该方法的敏感性高于鸡胚分离方法。从人工感染H9亚型禽流感病毒的发病鸡采集咽喉拭子、泄殖腔拭子进行荧光RT-PCR检测，结果显示人工感染后1-6天的咽喉拭子和泄殖腔拭子中都未检出病毒；人工感染后7-8天的咽喉拭子中都能检出和分离出病毒，但部分泄殖腔拭子中有未检出病毒的，表明咽喉拭子中病毒含量比泄殖腔拭子高。该方法简单、快速，可适用于禽流感临床快速诊断、活禽市场的禽流感监测和进出境口岸的检疫。