下肢深静脉瓣膜功能不全的治疗是目前血管外科界有待解决的难点之一,保守治疗和瓣膜环缩术都存在着远期效果差的问题,自体带瓣膜静脉移植则存在着血管管径不合适、移植后局部扩张、局部血栓形成、瓣膜抗倒流能力不够、瓣膜退变等问题。　　 21世纪处,随着血管组织工程学发展,国内外亦有学者开始尝试对静脉瓣膜进行组织工程学构建,并取得了初步进展。目前已完成的研究中,瓣膜来源主要有同种异体瓣膜脱细胞支架和同种异体小肠黏膜,种子细胞主要是血管内皮细胞和平滑肌细胞,前者在短期内瓣膜尚有功能,但12周后近半数瓣膜失去功能,主要考虑其种植的血管内皮细胞及平滑肌细胞凋亡所致;后者由于结构和生物力学差异,血栓形成及瓣膜功能不全较为严重。　　 本研究结合国内外目前研究的经验和教训,采用犬脱细胞带瓣膜颈静脉做为生物支架,骨髓源内皮组细胞作为种子细胞,从而构建组织工程血管,进而再移植到提取干细胞的犬体内,期望能构建远期通畅率高、瓣膜功能保留完好的组织功能学静脉瓣膜。全文分为四个部分:　　 第一部分、犬脱细胞带瓣膜静脉支架的制备　　 目的:探讨组织工程血管脱细胞血管支架的制备及其免疫原性的检测方法。　　 方法:取普通杂种犬的颈静脉,指压法确定瓣膜位置后,取7.0cm长的带瓣膜血管段,随机分为2组(每组6段):对照组、脱细胞组。实验组:1mol/L氯化钠溶液37℃持续振荡2小时后,在4℃4％去氧胆酸钠溶液中浸泡1小时,然后在PBS液洗涤5次,每次15分钟。对照组:单纯PBS液洗涤5次,每次15分钟。行HE、苦味酸一天狼星红、弹力纤维染色,光镜及扫描电镜观察血管内皮细胞、平滑肌细胞的脱落情况,以及血管弹力纤维、胶原纤维连续性是否完好,有无中断、消失,胶原纤维横纹是否消失,有无细胞结构或细胞碎片残留以及静脉瓣膜的弹力层、纤维组织和胶原结缔组织的完整性。体外进行物理学检测,对比两组血管瓣膜的形态和抗倒流能力,取小段(约2cm)两组血管,将其埋入同种异体犬皮下,分别于1天、3天、7天后取出,行HE染色观察细胞浸润情况,免疫组化方法检测血管脱细胞处理前后主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCI)的变化情况,并将检测结果作图像分析。　　 结果:犬颈静脉脱细胞血管支架呈半透明,质地柔软,顺应性良好。对照组光镜及扫描、透射电镜见静脉管壁结构完整,各层细胞结构清晰,苦味酸一天狼星红、弹力纤维染色见弹力纤维、胶原纤维连续性完好,纤维结构间被细胞占据,无空白区,瓣膜区弹力层、纤维组织和胶原结缔组织结构完整,表面覆以内皮细胞,瓣叶交汇处可见平滑肌细胞。脱细胞组未见细胞及其碎片成分,各层结构清晰可辨,纤维网架结构保持完整,弹力纤维卷曲呈波浪状,排列整齐、致密,无断裂,胶原纤维连续性好,横纹存在,原来内皮细胞、平滑肌细胞占据的地方变成纤维间的空白区。瓣膜区弹力层、纤维组织和胶原结缔组织结构完整,未见细胞残留。体外力学检测提示两组瓣膜的宽度、厚度均无统计学差异,但抗倒流能力实验组低于对照组,体内排斥HE染色发现实验组血管无明显炎性细胞浸润,对照组可见大量炎性细胞浸润,纤维组织破碎,免疫组化实验发现对照组血管内皮细胞及平滑肌细胞高度表达MHCI,阳性反应见于血管内膜,呈细胞形态分布;脱细胞组的阳性反应更少,只在中膜胶原纤维间有很少量免疫组化染色。图像分析得出阳性颗粒面积与视场面积比:对照组为(39.78±4.23)％,脱细胞组为(0.99±0.34)％,经方差分析两组间比较均有显著差异(P＜0.01)。　　 结论:通过去氧胆酸钠处理得到的犬脱细胞带瓣膜静脉支架能完好得保留静脉瓣膜的细胞外基质结构,同时能有效地降低其免疫原性。并具有一定的抗倒流作用。　　 第二部分、犬骨髓源EPCs体外分离、培养及鉴定　　 目的:建立犬骨髓源内皮祖细胞(EPCs)的体外分离纯化、扩增和鉴定的方法,为EPCs进一步作为种子细胞参与体外构建组织工程血管奠定基础。　　 方法:抽取犬髂后上棘骨髓,密度梯度离心,犬淋巴细胞分离液(ficoll)分离骨髓,得到骨髓单个核细胞悬液,采用EGM-2MV培养液置于预先Fn铺板的培养瓶中;倒置相差显微镜观察细胞形态,并绘制生长曲线;通过Dil-ac-LDL及UEA-I摄取实验检测EPCs的功能;在培养不同时间点,进行flk-1,CD133和VIII因子相关抗体免疫组化检测,并以内皮细胞和骨髓单个核干细胞作为对照;采用流式细胞仪检测CD133,VEGFR-2的表达。　　 结果:呈集落样生长的贴壁细胞平均10天汇合,每毫升骨髓可获得大约(1.3±0.3)×106个细胞,外观呈鹅卵石样,能摄取Dil-ac-LDL和UEA-I,flk-1,CD133和Ⅷ因子相关抗体免疫组化检测均呈阳性,流式细胞仪示EPCs培养10天后VEGFR-2和CD133双阳性细胞扩增达33倍。　　 结论:密度梯度离心结合贴壁分离培养法,以及消化传代能有效分离纯化和扩增骨髓源EPCs,分离培养的细胞具有EPCs的基本表型和特性,而且体外增殖活跃。能够满足体外构建组织工程血管的需要。　　 第三部分、组织工程带瓣膜静脉的体外构建　　 目的:探讨骨髓源内皮祖细胞复合脱细胞血管支架体外构建组织工程带瓣膜静脉的可行性。　　 方法:将培养的3代犬EPCs用0.125％胰酶消化,收集细胞,制成细胞悬液,细胞密度调整至5×106/ml,注入脱细胞支架静置12h后翻转90°,再注入等量细胞,重复4次。之后将支架转到自制的动态反应器中培养,每两天更换培养液1次。分别在血管培养1、4、10d时,取带静脉瓣膜组织进行光镜、电镜及免疫荧光观察EPCs在脱细胞支架上的黏附及牛长情况;10d后取组织工程血管组(n=6)、新鲜犬带瓣膜静脉组(n=6),测量其瓣膜厚度、宽度,用生物力学测定仪测定其抗倒流强度。。　　 结果:组织工程带瓣膜静脉培养过程中,HE、电镜及免疫荧光检查示第1d时已见EPCs细胞黏附在脱细胞血管瓣膜支架上,第4d见细胞已经开始增殖,较第1d明显增多,但分布不均。至第10d可见大量内皮祖细胞牛长于瓣膜纤维之间。体外力学检测提示两组瓣膜的宽度、厚度均无统计学差异,但抗倒流能力实验组低于对照组。　　 结论:犬骨髓源内皮祖细胞复合脱细胞带瓣膜静脉支架可于体外成功构建组织工程血管,虽然其抗倒流强度相对低于新鲜带瓣膜静脉,但仍可有效地防止静脉倒流的发生。　　 第四部分、组织工程带瓣膜静脉体内移植的实验研究　　 目的:建立犬颈静脉移植的动物模型,观察经体外构建的组织工程带瓣膜静脉在移植后的组织形态学变化、内皮细胞覆盖情况及抗倒流能力等。　　 方法:将经体外构建的BrdU标记的EPCs内衬犬组织工程带瓣膜静脉移植入所抽取骨髓的同一犬体内并设立对照组移植组。术后3d、7d、15d、30d、60d、90d进行彩色多普勒超声检查,将犬麻醉后由平卧位逐渐升至头低脚高位,观察静脉通畅及瓣膜远心端静脉血液倒流情况。90d后取出通畅的移植物标本,进行病理学检测。光镜、扫描电镜观察血管内膜、弹力纤维、胶原纤维。BrdU及Ⅷ因子相关抗原的免疫荧光染色,激光共聚焦荧光显微镜观察血管内膜。　　 结果:移植术后7天,所有对照组移植物均闭塞,病理显示全段血管内膜增生明显,附壁血栓形成,未见内皮细胞生长。有两例实验组移植物闭塞,病理显示吻合口处内膜增生明显,伴有附壁血栓形成。实验组90d内各观察点彩色多普勒未发现有血液倒流,90d后,实验组通畅血管病理可见内皮完全覆盖内表面,形态规整,无明显内膜增生。免疫组化显示,组织工程血管管壁内膜及瓣膜表面均覆盖细胞,呈vWF阳性,排列致密、规整,为血管内皮细胞,血管壁间少量细胞呈α-SMA阳性,散在排列,为平滑肌细胞,瓣膜处α-SMA染色阴性。激光共聚焦荧光显微镜下观察,组织工程血管管壁内膜及瓣膜表面仍可见CM-DiI染色阳性细胞,发红光。此外,血管壁内也有少数CM-DiI染色阳性细胞;进行vW因子免疫荧光检测发现,vW因子阳性细胞已完全覆盖组织工程血管管壁内膜及瓣膜表面表面,细胞浆发绿色荧光,且部分vW因子阳性细胞同时表现CM-DiI染色阳性发黄光,提示EPCs已分化为内皮细胞。　　 结论:带瓣膜静脉脱细胞支架组复合EPCs构建的组织工程带瓣膜静脉牛物相容性好,EPCs在犬体内局部微环境的诱导下可以分化为内皮细胞。移植到受体需要血管重建的部位后通畅率较高,能有效地阻止静脉倒流,有望成为研究重建静脉瓣膜功能的新途径。