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软骨组织工程的发展为关节软骨缺损的修复提供了新的思路和方法。利用软骨组织工程修复关节软骨缺损时，需要将体外培养扩增后的种子细胞，如干细胞、软骨细胞等，种植于支架材料中，从而在相关的生长因子作用下实现软骨组织的修复和重建。可注射水凝胶用作软骨组织工程支架时，不仅需要为种子细胞的生长提供支撑作用，还需要具备促进种子细胞增殖和分化的功能。其中，可注射酶催化交联水凝胶由于其形成条件温和、反应速率容易控制、具有良好的生物相容性而受到了广泛关注。酶催化交联水凝胶采用天然的酶作为催化剂，安全性高，不会引入有机溶剂，具有良好的生物相容性，便于包载药物、细胞和生物活性分子，不会对细胞造成损伤，且能够避免药物及生物活性分子的失活。酶催化交联水凝胶的反应速率容易控制，可以通过调节酶的催化活性进行有效调控，可控的反应速率能够有效地防止水凝胶的前驱体溶液的扩散。酶催化交联水凝胶还可以进行原位注射，适用于修复形状复杂的组织缺损部位，不仅避免了预塑型支架材料难以与修复部位吻合的缺陷，还避免了植入型支架材料带来的手术创伤及并发炎症等，实现微创治疗。 本论文制备了多种可注射酶催化交联水凝胶，侧重研究酶催化交联水凝胶的性能调控及其对软骨细胞的表型、骨髓间充质干细胞的软骨向分化的影响，评价了可注射酶催化交联水凝胶作为3D细胞载体和软骨组织工程支架的可行性。具体研究内容和主要结论如下: (1)从酶催化苯酚类化合物的聚合出发，设计并合成了一种两端为苯酚基团的亲水性的线型聚合物TA-SA-PEG-SA-TA，对该线型聚合物的成凝胶行为和水凝胶性能进行了考察，通过改变聚合物、HRP的浓度和H2O2与苯酚基团的摩尔比，实现了对水凝胶的成凝胶时间和强度的有效调控。进一步合成了单端为苯酚基团的亲水性的线型聚合物mPEG-SA-TA，深入研究了其在HRP和H2O2的存在下的酶催化反应，结果表明，在HPR和H2O2的存在下，mPEG-SA-TA发生酶催化反应，其末端的苯酚基团能够相互反应形成寡聚体。我们推断，在HPR和H2O2的存在下，线型聚合物TA-SA-PEG-SA-TA采用同样的机理制备得到酶催化交联水凝胶，当H2O2与TA的摩尔比≥0.6时，TA-SA-PEG-SA-TA通过苯酚基团相互反应生成较多的寡聚体，能够形成足够多的交联点，从而制备得到水凝胶，而当H2O2与TA的摩尔比为0.3时，TA-SA-PEG-SA-TA上的苯酚基团虽然也能够相互反应生成部分寡聚体，但产物中仍存在较多的单体，交联点数量较少，无法形成水凝胶。成功论证了两端为苯酚基团的线型聚合物的酶催化成凝胶机理，拓宽了酶催化交联水凝胶的材料选择范围。 (2)将酶催化的交联方式引入聚氨基酸领域，制备了一种新型的基于聚谷氨酸-g-酪胺/聚乙二醇的可注射酶催化交联水凝胶，水凝胶的理化性能，如机械强度、微孔结构、溶胀率等能够通过改变HRP、H2O2的浓度进行有效调节。进一步评价了水凝胶在体内外的生物相容性。细胞实验表明，该水凝胶及其浸提液具有良好的细胞相容性。用作3D细胞载体时，低浓度的H2O2制备的水凝胶具有更大的多孔结构，便于营养物质的渗透和细胞代谢产物的扩散，能够提供较大的空间以供细胞生长，更有利于细胞增殖。将水凝胶的前驱体溶液皮下注射到大鼠背部，水凝胶能够原位形成，14周后完全降解。水凝胶在降解过程中不会引起组织的病变，具有良好的生物相容性。 (3)制备了一种基于聚谷氨酸-g-酪胺的酶催化交联水凝胶，水凝胶的理化性能，如强度、微孔结构及体外降解性能等能够通过改变聚合物浓度进行有效调控。聚合物材料及水凝胶具有良好的细胞相容性。水凝胶能够在大鼠皮下完全降解，且降解过程中不会引起组织的病变，具有良好的生物相容性。通过改变聚合物浓度构建了不同的水凝胶微环境，选择兔的骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为种子细胞，考察不同的水凝胶微环境对BMSCs的3D细胞形貌、增殖以及软骨向分化等的影响。结果表明，低浓度的水凝胶具有更大的多孔结构，便于营养物质的渗透和细胞代谢产物的扩散，能够提供较大的空间，促进BMSCs的铺展及增殖。在诱导培养基中培养4周后，BMSCs在低浓度的水凝胶中形成结节，能够表达和分泌Ⅱ型胶原、糖胺聚糖等软骨特异性细胞外基质，促进BMSCs向软骨分化。 (4)从模拟天然软骨细胞外基质中蛋白多糖的结构出发，设计并制备了基于类糖肽的可注射酶催化交联水凝胶，通过改变聚合物、HRP、H2O2浓度能够有效调控水凝胶的理化性能。聚合物材料及水凝胶具有良好的细胞相容性。水凝胶能够在大鼠皮下完全降解，且降解过程中不会引起组织的病变，具有良好的生物相容性。以类糖肽水凝胶作为仿生软骨组织工程支架材料，选用软骨细胞为种子细胞，评价了该凝胶作为软骨组织工程支架材料的可行性。结果表明，在体外3D培养和裸鼠皮下模型中，类糖肽水凝胶有利于软骨细胞的存活和增殖，促进去分化的软骨细胞在类糖肽水凝胶中3D环境中再分化，表达并分泌软骨特异性细胞外基质，如Ⅱ型胶原、糖胺聚糖等，在软骨组织工程中具有一定的应用潜力。